Izvedba četiri testa amplifikacije nukleinske kiseline za identifikaciju SARS-CoV-2 u Etiopiji

Hvala što ste posjetili Nature.com. Koristite verziju preglednika s ograničenom CSS podrškom. Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). Osim toga, kako bismo osigurali stalnu podršku, prikazujemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Prikazuje vrtuljak od tri slajda odjednom. Koristite gumbe Prethodno i Sljedeće za pomicanje kroz tri slajda istovremeno ili koristite gumbe klizača na kraju za kretanje kroz tri slajda odjednom.
Od izbijanja bolesti koronavirusa (COVID-19) 2019., mnogi komercijalni testovi amplifikacije nukleinske kiseline (NAAT) razvijeni su diljem svijeta i postali su standardni testovi. Iako je nekoliko testova brzo razvijeno i primijenjeno na laboratorijske dijagnostičke testove, izvedba ovih testova nije procijenjena u različitim okruženjima. Stoga je ova studija imala za cilj procijeniti učinkovitost Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI i Sansure Biotech testova pomoću Composite Reference Standard (CRS). Studija je provedena u Etiopskom institutu za javno zdravstvo (EPHI) od 1. do 30. prosinca 2020. Ekstrahirana su 164 nazofaringealna uzorka pomoću QIAamp RNA mini kita i Abbott sustava za pripremu DNK uzorka. Od 164 uzorka, 59,1% bilo je pozitivno, a 40,9% negativno na CRS. Pozitivnost Sansure Biotech bila je značajno niska u usporedbi s CRS-om (p < 0,05). Pozitivnost Sansure Biotech bila je značajno niska u usporedbi s CRS-om (p < 0,05). Pozitivni rezultati Sansure Biotech bili su znatno niži u usporedbi s CRS (p < 0,05). Pozitivni rezultati Sansure Biotech bili su značajno niži u usporedbi s CRS-om (p < 0,05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低．(p < 0,05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低．(p < 0,05). U Sansure Biotechu postignuti su znatno manji pozitivni rezultati u usporedbi s CRS-om (p < 0,05). Sansure Biotech imao je značajno manje pozitivnih rezultata u usporedbi s CRS-om (p < 0,05).Sveukupno slaganje četiriju analiza bilo je 96,3–100% u usporedbi s CRS-om. Uz nisku stopu pozitivnosti testa Sansure Biotech, izvedba sva četiri testa bila je gotovo usporediva. Kao takav, Sansure Biotech [Research Only (RUO)] test zahtijeva dodatnu validaciju za njegovu upotrebu u Etiopiji. Konačno, potrebno je razmotriti dodatna istraživanja kako bi se ocijenili testovi s odgovarajućim tvrdnjama proizvođača.
Laboratorijsko testiranje dio je Strateškog plana Svjetske zdravstvene organizacije (WHO) za pripravnost i odgovor na bolest koronavirusa 2019. (COVID-19) (SPRP). WHO savjetuje da zemlje moraju izgraditi laboratorijske kapacitete kako bi poboljšale spremnost, pravilno upravljanje slučajevima, budnost i brz odgovor na izazove javnog zdravlja. Ovo sugerira da je uloga laboratorija ključna za karakterizaciju bolesti i epidemiologiju novih uzročnika zaraze i kontrolu njihovog širenja.
Za dijagnozu COVID-19 potrebne su epidemiološke i medicinske informacije, osobni simptomi/znakovi te radiografski i laboratorijski podaci2. Otkako je epidemija COVID-19 prijavljena u Wuhanu u Kini, mnogi komercijalni testovi amplifikacije nukleinske kiseline (NAAT) razvijeni su diljem svijeta. Lančana reakcija polimeraze obrnute transkripcije u stvarnom vremenu (rRT-PCR) koristi se kao rutinska i standardna metoda za laboratorijsku dijagnostiku teške infekcije akutnim respiratornim sindromom 2 (SARS-CoV-2)3. Molekularno otkrivanje SARS-CoV-2 obično se temelji na genima N (gen proteina nukleokapsida), E (gen proteina ovojnice) i RdRp (gen RNA-polimeraze ovisan o RNK) u ORF1a/b (otvoreni okvir čitanja 1a/b) . gen) regija identificirana iz virusnog genoma. Smatraju se glavnim očuvanim regijama koje se nalaze u virusnim genomima za prepoznavanje virusa4. Među tim genima, geni RdRp i E imaju visoku analitičku osjetljivost detekcije, dok N gen ima nisku analitičku osjetljivost5.
Učinkovitost PCR testova može varirati ovisno o različitim čimbenicima kao što su: reagensi za ekstrakciju, reagensi za pojačanje/detekciju, metoda ekstrakcije, kvaliteta PCR stroja i drugih instrumenata. Od travnja 2020. više od 48 različitih dijagnostičkih uređaja iz devet zemalja dobilo je odobrenje za hitnu upotrebu (EUA) za dijagnostiku COVID-196. U Etiopiji se više od 14 PCR platformi u stvarnom vremenu koristi za PCR detekciju SARS-CoV-2 u 26 javnih zdravstvenih ustanova, uključujući ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 i Quant-studio7. Osim toga, dostupni su različiti setovi PCR testova, kao što su Daan Gene test, Abbott SARS-CoV-2 test, Sansure Biotech test i SARS-CoV-2 BGI test. Iako je rRT-PCR vrlo osjetljiv, neki pacijenti s COVID-19 prijavljuju lažno negativne rezultate zbog nedovoljnih kopija virusne ribonukleinske kiseline (RNA) u uzorcima zbog nepravilnog prikupljanja, transporta, skladištenja i rukovanja te laboratorijskog testiranja. stanja i djelovanja osoblja8. Osim toga, pogrešno rukovanje uzorkom ili kontrolom, postavljanje praga ciklusa (Ct) i unakrsna reaktivnost s drugim patogenim nukleinskim kiselinama ili neaktivnom/rezidualnom SARS-CoV-2 RNA može dovesti do lažno pozitivnih rezultata u rRT-PCR9 analizama. Dakle, jasno je da PCR testovi doista mogu identificirati nositelje fragmenata gena, jer ne mogu čak ni razlikovati stvarno aktivne virusne gene, tako da testovi mogu identificirati samo nositelje, a ne i pacijente10. Stoga je važno procijeniti učinkovitost dijagnostike korištenjem standardnih metoda u našem okruženju. Iako su mnogi NAAT reagensi dostupni u Etiopskom institutu za javno zdravstvo (EPHI) i diljem zemlje, još uvijek nije objavljena komparativna procjena njihove učinkovitosti. Stoga je ova studija imala za cilj procijeniti komparativnu učinkovitost komercijalno dostupnih kompleta za otkrivanje SARS-CoV-2 rRT-PCR-om pomoću kliničkih uzoraka.
Ukupno 164 sudionika sa sumnjom na COVID-19 bila su uključena u ovu studiju. Većina uzoraka bila je iz centara za liječenje (118/164 = 72%), dok je preostalih 46 (28%) sudionika bilo iz centara za neliječenje. Među sudionicima koji nisu bili liječeni u centru, 15 (9,1%) imalo je klinički sumnjive slučajeve, a 31 (18,9%) je imao kontakt s potvrđenim slučajevima. Devedeset tri (56,7%) sudionika bili su muškarci, a srednja (± SD) dob sudionika bila je 31,10 (± 11,82) godina.
U ovoj studiji utvrđene su pozitivne i negativne stope četiri testa na COVID-19. Stoga su pozitivne stope testa Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene 2019-nCoV testa, SARS-CoV-2 BGI testa i Sansure Biotech 2019-nCoV testa bile 59,1%, 58,5%, 57,9% i 55,5% redom . Pozitivni i negativni kompozitni referentni standard (CRS) rezultati bili su 97 (59,1%) odnosno 67 (40,9%) (Tablica 1). U ovoj studiji, definicija CRS-a temeljila se na pravilu "bilo koji pozitivan", prema kojem se od četiri rezultata testa, dva ili više rezultata testa koji su dali isti rezultat smatraju istinski pozitivnim ili negativnim.
U ovoj studiji pronašli smo negativni postotak slaganja (NPA) od 100% (95% CI 94,6-100) za sve analize u usporedbi s CRS-om. Analiza Sansure Biotechnology pokazala je minimalni PPA od 93,8% (95% CI 87,2-97,1), a analiza Daan Gene 2019-nCoV imala je ukupno slaganje od 99,4% (95% CI 96,6-99,9). Nasuprot tome, ukupna podudarnost između testa SARS-CoV-2 BGI i testa Sansure Biotech 2019-nCoV bila je 98,8% odnosno 96,3% (Tablica 2).
Cohenov kappa koeficijent slaganja između rezultata CRS i Abbott SARS-CoV-2 testa bio je potpuno dosljedan (K = 1,00). Slično tome, Cohenove kappa vrijednosti koje su otkrili Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI i Sansure Biotech 2019-nCoV također su u potpunosti u skladu s CRS-om (K ≥ 0,925). U ovoj usporednoj analizi, hi-kvadrat test (McNemarov test) pokazao je da su rezultati testa Sansure Biotech 2019-nCoV značajno različiti od rezultata CRS (p = 0,031) (Tablica 2).
Kao što je prikazano na sl.1 postotak najniže vrijednosti Ct (< 20 Ct) testa Abbott SARS-CoV-2 (kombinirani gen RdRp i N) bio je 87,6%, a Ct vrijednost gena ORF1a/b testa Sansure Biotech 2019-nCoV pokazala je da je postotak niske Vrijednost Ct (< 20 Ct) bila je 50,3% i visoka vrijednost Ct (36-40 Ct) bio je 3,2%. 1 postotak najniže vrijednosti Ct (< 20 Ct) testa Abbott SARS-CoV-2 (kombinirani gen RdRp i N) bio je 87,6%, a Ct vrijednost gena ORF1a/b testa Sansure Biotech 2019-nCoV pokazala je da je postotak niske Vrijednost Ct (< 20 Ct) bila je 50,3% i visoka vrijednost Ct (36-40 Ct) bio je 3,2%.Kao što je prikazano na sl.1, postotak manjeg značenja Ct (< 20 Ct) analiza Abbott SARS-CoV-2 (kombinirani gen RdRp i N) iznosio je 87,6%, a vrijednost Ct gena ORF1a/b analiza Sansure Biotech 2019-nCoV pokazala je postotak niskog značenja Ct (< 20 Ct) sastavljen od 50,3%, visoko značenje Ct (36–40 Ct) sastavljeno od 3,2%. 1, postotak najniže vrijednosti Ct (< 20 Ct) analize Abbott SARS-CoV-2 (kombinirani gen RdRp i N) bio je 87,6%, a Ct vrijednost analize gena ORF1a/b Sansure Biotech 2019-nCoV pokazala je da je postotak niske vrijednosti Ct (< 20 Ct) činio 50,3%, a visoke vrijednosti Ct (36–40 Ct) iznosio je 3,2%.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（< 20 Ct）为87,6%，Sansure Biotech 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%，高Ct 值(36-40 Ct)的百分比为3,2%。 Kao što je prikazano na slici 1, najniži postotak Ct vrijednosti (< 20 Ct) Abbott SARS-CoV-2 testa (kombinacija RdRp i N gena) je 87,6%, Ct vrijednost gena ORF1a/b Sansure Biotech 2019-nCoV testa pokazuje nizak Ct值(< 20 Ct) 的 postotak je 50,3%,高Ct 值(36–40 Ct) 的 postotak je 3,2%. Kao što je prikazano na slici 1, analiza Abbott SARS-CoV-2 (susjed gena RdRp i N) imala je samo nisko postotno značenje Ct (< 20 Ct) u veličini od 87,6%, a značenje Ct gena ORF1a/b u istraživanju Sansure Biotech 2019 - Analiza nCoV pokazala je nizak Ct. Kao što je prikazano na slici 1, Abbott SARS-CoV-2 test (kombinacija gena RdRp i N) imao je najnižu postotnu vrijednost Ct (< 20 Ct) od 87,6%, dok je Ct vrijednost gena ORF1a/b u Sansure Studija Biotech 2019 – Analiza nCoV-a pokazala je nizak Ct. Postotak vrijednosti (< 20 Ct) iznosio je 50,3%, a postotak visoke vrijednosti Ct (36–40 Ct) iznosio je 3,2%. Postotak vrijednosti (< 20 Ct) bio je 50,3%, a postotak visokih vrijednosti Ct (36-40 Ct) bio je 3,2%.Abbott SARS-CoV-2 B test zabilježio je Ct vrijednosti iznad 30. S druge strane, na testu BGI SARS-CoV-2 gen ORF1a/b imao je visoku vrijednost Ct (> 36 Ct) postotak je bio 4% (slika 1). S druge strane, na testu BGI SARS-CoV-2 gen ORF1a/b imao je visoku vrijednost Ct (> 36 Ct) postotak je bio 4% (slika 1). S druge strane, u analizi BGI SARS-CoV-2 gena ORF1a/b navedeno je visoko značenje Ct (> 36 Ct), postotak koji je činio 4% (slika 1). S druge strane, u analizi BGI SARS-CoV-2 gen ORF1a/b imao je visoku vrijednost Ct (>36 Ct), čiji je postotak bio 4% (slika 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比为4%(图1）。 S druge strane, u BGI detekciji SARS-CoV-2, postotak gena ORF1a/b s visokom Ct vrijednošću (>36 Ct) je 4% (Slika 1). S druge strane, u analizi BGI SARS-CoV-2 postotak gena ORF1a/b s visokim vrijednostima Ct (>36 Ct) iznosio je 4% (slika 1). S druge strane, u analizi BGI SARS-CoV-2, postotak ORF1a/b gena s visokim Ct vrijednostima (>36 Ct) bio je 4% (slika 1).
U ovoj studiji uzeli smo 164 nazofaringealna uzorka. Za sve vrste testova, izolacija i amplifikacija RNA provedena je korištenjem metoda i kitova koje su preporučili odgovarajući proizvođači.
Ova je studija pokazala da Abbottov test za SARS-CoV-2 ima istu učinkovitost otkrivanja kao CRS, sa 100% pozitivnom, negativnom i ukupnom podudarnošću. Cohenov kappa sporazum je 1,00, što ukazuje na potpuno slaganje s CRS-om. Slična studija Sveučilišta Washington u SAD-u otkrila je da je ukupna osjetljivost i specifičnost Abbott testa za SARS-CoV-2 bila 93%, odnosno 100%, u usporedbi s laboratorijski određenim testom (LDA) CDC-a. . 11. Abbottov sustav detekcije SARS-CoV-2 temelji se na istovremenoj kombiniranoj detekciji N i RdRp gena, jer su oba gena osjetljivija, što minimalizira lažno negativne rezultate12. Studija u Beču, u Austriji, također je pokazala da veliki volumeni ekstrakcijskih uzoraka i volumeni eluenta za detekciju minimiziraju učinke razrjeđivanja i povećavaju učinkovitost detekcije13. Stoga se Abbottovo savršeno podudaranje za test SARS-CoV-2 može povezati sa sustavom za otkrivanje platforme koji istovremeno detektira kombinatorne gene, ekstrahira veliki broj uzoraka (0,5 ml) i koristi veliku količinu eluenta (40 µl).
Naši su rezultati također pokazali da je učinkovitost detekcije Daan genetskog testa bila gotovo ista kao kod CRS-a. Ovo je u skladu sa studijom14 provedenom na Sveučilištu Anhui u Huainanu, Kina, i tvrdnjom proizvođača o 100% pozitivnom slaganju. Unatoč izvješćima o dosljednim rezultatima, jedan je uzorak bio lažno negativan nakon ponovnog testiranja istog eluata, ali je bio pozitivan u testovima Abbott SARS-CoV-2 i Sansure Biotech nCoV-2019. To sugerira da može postojati varijabilnost u rezultatima između različitih vrsta testova. Ipak, u studiji provedenoj u Kini15, rezultat testa Daan Gene bio je značajno drugačiji (p < 0,05) u usporedbi s njihovim laboratorijski definiranim referentnim testom. Ipak, u studiji provedenoj u Kini15, rezultat testa Daan Gene bio je značajno drugačiji (p < 0,05) u usporedbi s njihovim laboratorijski definiranim referentnim testom. Ne manje od toga, u istraživanju provedenom u Kini15, rezultati analize Daan Gene značajno su se razlikovali (p < 0,05) od njihove laboratorijske etalon analize. Međutim, u studiji u Kini15, rezultat analize Daan Gene bio je značajno drugačiji (p < 0,05) od njihove referentne laboratorijske analize.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异＂(p < 0,05).然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Međutim, u istraživanju provedenom u Kini15, rezultati genetičkog testa Daan značajno su se razlikovali (p < 0,05) u usporedbi s njegovim etalonskim laboratorijskim testom. Međutim, u studiji u Kini15, rezultati Daanovog genetskog testa bili su značajno drugačiji (p < 0,05) u usporedbi s referentnim laboratorijskim testom.Ova razlika može biti posljedica osjetljivosti referentnog testa za otkrivanje SARS-CoV-2, a daljnje studije mogu biti važne za utvrđivanje uzroka.
Osim toga, naša je studija procijenila komparativnu izvedbu SARS-CoV-2 BGI testa s CRS-om, pokazujući izvrsno pozitivno postotno slaganje (PPA = 97,9%), negativno postotno slaganje (NPA = 100%) i ukupno postotno slaganje prema spolu ( OPA). ). = 98,8%). Cohenove Kappa vrijednosti su pokazale dobro slaganje (K = 0,975). Studije u Nizozemskoj16 i Kini15 pokazale su dosljedne rezultate. SARS-CoV-2 BGI test je test detekcije jednog gena (ORF1a/b) koji koristi 10 µl eluata za pojačanje/detekciju. Unatoč dobrom statističkom slaganju s našim referentnim rezultatima, analizom su izostala dva pozitivna uzorka (1,22%) od ukupnog uzorka. To može imati velike kliničke implikacije na dinamiku prijenosa na razini bolesnika i zajednice.
Druga komparativna analiza uključena u ovu studiju bila je Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO) analiza; ukupni postotak podudaranja bio je 96,3%. Snaga slaganja određena je i Cohenovom Kappa vrijednošću, koja je iznosila 0,925, što ukazuje na potpuno slaganje s CRS-om. Opet, naši su rezultati identični studijama provedenim na Sveučilištu Central South u Changsha, Kina, i na Odjelu kliničkog laboratorija Narodne bolnice Liuzhou, grad Liuzhou, Kina17. Iako je zabilježena gore navedena dobra statistička podudarnost, hi-kvadrat test (MacNemarov test) pokazao je da je rezultat Sansure Biotech testa imao statistički značajnu razliku u usporedbi s CRS (p < 0,005). Iako je zabilježena gore navedena dobra statistička podudarnost, hi-kvadrat test (MacNemarov test) pokazao je da je rezultat Sansure Biotech testa imao statistički značajnu razliku u usporedbi s CRS (p < 0,005). Unatoč tomu da je utvrđeno da je navedeno više dobra statistička usklađenost, kriterij hi-kvadrata (kriterij Maknemara) pokazao je da rezultati analize Sansure Biotech imaju statistički značajnu razliku u usporedbi s CRS (p < 0,005). Iako je gore zabilježeno dobro statističko slaganje, hi-kvadrat test (McNemarov test) pokazao je da je rezultat Sansure Biotech testa imao statistički značajnu razliku u usporedbi s CRS (p < 0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性，但卡方检验（MacNemar 检验）表明，Sansure Biotech 检测的结果与CRS相比具有统计学显着差异＂ (p < 0,005).尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（macnemar 检验 表明 ， ， sansure biotech 检测 结果与 crs 相比 具有 显着 （（(p <0,005。。。。。。。。。。。。。。。。。。）))) Bez obzira na to što je istaknuto više dobra statistička usklađenost, kriterij hi-kvadrata (kriterij Maknemara) pokazao je statistički značajnu razliku (p < 0,005) između analize Sansure Biotech i CRS. Usprkos prethodno navedenom dobrom statističkom slaganju, hi-kvadrat test (McNemarov test) pokazao je statistički značajnu razliku (p < 0,005) između Sansure Biotech testa i CRS-a.Utvrđeno je da je šest uzoraka (3,66%) lažno negativno u usporedbi s CRS-om (dodatna tablica 1); ovo je vrlo važno, posebno s obzirom na dinamiku prijenosa virusa. Gore navedeni podaci također podržavaju ovu nisku stopu otkrivanja15.
U ovoj studiji, Ct vrijednosti su određene za svaki test i odgovarajuću platformu, s najnižom srednjom Ct vrijednošću prijavljenom u Abbott SARS-CoV-2 testu. Ovaj rezultat može biti povezan s Abbottovim sustavom simultanog kombiniranog genetskog testiranja za otkrivanje SARS-CoV-2. Prema tome, prema slici 1, 87,6% rezultata Abbott SARS-CoV-2 imalo je Ct vrijednosti ispod 20. Samo mali broj rezultata uzoraka (12,4%) bio je u rasponu 20-30. Vrijednosti Ct iznad 30 nisu zabilježene. Osim Abbottove upotrebe SARS-CoV-2 panela formata genetskog testiranja, ovaj rezultat može biti povezan s donjom granicom detekcije (32,5 RNA kopija/mL)18, što je tri puta niže od donje granice tvrtke od 100 RNA kopija /mL. ml) 19.
Ova studija ima neka ograničenja: prvo, nemamo standardne/referentne metode [kao što je viral load ili drugi laboratorijski testovi (LDA)] zbog nedostatka resursa. Drugo, svi uzorci korišteni u ovoj studiji bili su nazofaringealni brisevi, dok rezultati nisu bili primjenjivi na druge vrste uzoraka, i treće, veličina našeg uzorka bila je mala.
Ova studija uspoređivala je učinkovitost četiri rRT-PCR testa za SARS-CoV-2 koristeći nazofaringealne uzorke. Svi testovi detekcije imali su gotovo usporedivu izvedbu, s iznimkom Sansure Biotech testa. Osim toga, niska stopa pozitivnosti utvrđena je u testu Sansure Biotech u usporedbi s CRS (p < 0,05). Osim toga, niska stopa pozitivnosti utvrđena je u testu Sansure Biotech u usporedbi s CRS (p < 0,05). Osim toga, u testu Sansure Biotech zabilježen je nizak postotak pozitivnih rezultata u usporedbi s CRS (p < 0,05). Osim toga, Sansure Biotech test pokazao je nizak postotak pozitivnih rezultata u usporedbi s CRS (p < 0,05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低 (p < 0,05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低 (p < 0,05). Osim toga, analiza Sansure Biotech dala je niži stupanj pozitivnih rezultata u usporedbi s CRS (p < 0,05). Osim toga, Sansure Biotech test imao je nižu stopu pozitivnosti u usporedbi s CRS (p < 0,05).Analiza Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) PPA, NPA i ukupnog slaganja premašila je 93,5% s Cohen Kappa vrijednošću slaganja od 0,925. Naposljetku, Sansure Biotech Assay (RUO) treba daljnju validaciju za upotrebu u Etiopiji, a potrebno je razmotriti dodatna istraživanja za procjenu tvrdnji pojedinačnih proizvođača.
Dizajn komparativne studije proveden je u četiri zdravstvene ustanove u Addis Abebi, bolnici Eka Kotebe, Millennium Church Treatment Centre, Zewooditu Memorial Hospital i St. Peter's Specialist Hospital za tuberkulozu. Podaci su prikupljeni između 1. i 31. prosinca 2020. Medicinske ustanove za ovu studiju namjerno su odabrane na temelju velikog broja slučajeva i dostupnosti glavnih centara za liječenje u gradu. Slično tome, instrumenti, uključujući ABI 7500 i Abbott m2000 instrumente za PCR u stvarnom vremenu, odabrani su prema preporukama proizvođača NAAT reagensa, a četiri kompleta za detekciju PCR odabrana su za ovu studiju, budući da je većina laboratorija u Etiopiji koristila barem najmanje njih četiri. Genski test, Abbott SARS-CoV-2 test, Sansure Biotech test i SARS-CoV-2 BGI test obavljen tijekom studije).
Testiranje na SARS-CoV-2 obavljeno je od 1. do 30. prosinca 2020. pomoću 3 ml medija za prijenos virusa (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, Kina) od pojedinaca pod istragom za COVID-19 upućenih EPHI-ju. Nazofaringealne uzorke prikupili su obučeni sakupljači uzoraka i poslali ih u EPHI u trostrukim paketima. Prije izolacije nukleinske kiseline, svakom uzorku se dodjeljuje jedinstveni identifikacijski broj. Ekstrakcija se izvodi iz svakog uzorka odmah po dolasku ručnim i automatskim metodama ekstrakcije. Dakle, za automatsku ekstrakciju Abbott m2000, 1,3 ml (uključujući 0,8 ml mrtvog volumena i 0,5 ml ulaznog volumena ekstrakcije) uzorka ekstrahirano je iz svakog uzorka i prošlo kroz Abbott DNA Sample Preparation System (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, SAD). ) Serija od 96 [92 uzorka, dvije kontrole za otkrivanje i dvije kontrole bez šablona (NTC)] uključena je u cjelokupni proces (preuzimanje i otkrivanje) dvije runde SARS-CoV-2 (EUA) u stvarnom vremenu. rudarstvo. Slično, za ručno izdvajanje, koristite iste uzorke (za automatsko izdvajanje i otkrivanje). Dakle, tijekom procesa, 140 µl uzoraka je alikvotirano i ekstrahirano korištenjem QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Njemačka) u serijama od 24 (uključujući 20 uzoraka, dvije kontrole testa i dva NTC-a) tijekom devet krugova. Ručno ekstrahirani eluati pojačani su i detektirani korištenjem termalnog ciklera ABI 7500 pomoću BGI testa SARS-CoV-2, Daan Gene testa i Sansure Biotech testa.
Automatizirana izolacija i pročišćavanje SARS-CoV-2 virusne RNK slijedi princip magnetskih kuglica pomoću Abbott reagensa za pripremu DNK uzoraka. Inaktivacija uzoraka i solubilizacija virusnih čestica provodi se pomoću deterdženta koji sadrži gvanidin izotiocijanat za denaturaciju proteina i inaktivaciju RNaze. RNA se zatim odvaja od proteina odvajanjem čvrste faze pomoću silicijevog dioksida, tj. gvanidinijeva sol i alkalni pH pufera za lizu pospješuju vezanje nukleinskih kiselina na silicij (SiO2). Korak ispiranja uklanja preostale proteine ​​i ostatke kako bi se proizvela bistra otopina. Transparentna RNA izolirana je iz mikročestica na bazi silicija pomoću magnetskog polja instrumenta20,21. S druge strane, ručna izolacija i pročišćavanje RNA provodi se metodom spin kolone pomoću centrifugiranja umjesto magnetskog postolja i odvajanja mikročestica od eluensa.
Abbottov test otkrivanja SARS-CoV-2 u stvarnom vremenu (Abbott Molecular, Inc.) proveden je u skladu s uputama proizvođača, koji su dobili EUA19,22 od WHO-a i FDA-e. U ovom protokolu, inaktivacija uzorka prije ekstrakcije provedena je u vodenoj kupelji na 56 °C tijekom 30 minuta. Nakon inaktivacije virusa, provedena je ekstrakcija nukleinske kiseline na Abbott m2000 SP instrumentu iz 0,5 ml VTM pomoću Abbott m2000 sustava za pripremu uzoraka DNA. prema proizvođaču. Umnožavanje i detekcija provedena je pomoću Abbott m2000 RT-PCR instrumenta, a dualna detekcija je provedena za RdRp i N gene. ROX) i VIC P (zaštićena boja) za ciljanje i otkrivanje unutarnjih kontrola, omogućujući istovremeno otkrivanje oba produkta pojačanja 19 .
Metoda detekcije amplifikacije ovog kompleta temelji se na RT-PCR tehnologiji u jednom koraku. Geni ORF1a/b i N odabrani su kao očuvane regije od strane Daan Gene Technology za otkrivanje amplifikacije ciljne regije. Specifični primeri i fluorescentne sonde (N genske sonde označene s FAM, ORF1a/b sonde označene s VIC) dizajnirane su za otkrivanje SARS-CoV-2 RNA u uzorcima. Konačni eluens i glavne mješavine pripremljene su dodavanjem 5 µl eluensa u 20 µl glavne mješavine do konačnog volumena od 25 µl. Amplifikacija i detekcija su provedene istovremeno na ABI 750024 PCR instrumentu u stvarnom vremenu.
Geni ORF1a/b i N detektirani su pomoću Sansure Biotech nCoV-2019 dijagnostičkog kompleta za nukleinske kiseline (fluorescentna PCR detekcija). Pripremite specifične probe za svaki ciljni gen odabirom FAM kanala za ORF1a/b regiju i ROX kanala za N gen. Ovom kompletu za analizu, eluens i reagensi glavne mješavine dodaju se na sljedeći način: pripremite 30 µl reagensa glavne mješavine i 20 µl eluiranog uzorka za detekciju/amplifikaciju. Za umnožavanje/detekciju korišten je PCR u stvarnom vremenu ABI 750025.
SARS-CoV-2 BGI test je fluorescentni rRT-PCR komplet u stvarnom vremenu za dijagnozu COVID-19. Ciljna regija nalazi se u regiji ORF1a/b genoma SARS-CoV-2, što je metoda detekcije jednog gena. Osim toga, ljudski gen za domaćinstvo β-aktin interno je reguliran ciljni gen. Glavna mješavina se priprema miješanjem 20 µl reagensa glavne mješavine i 10 µl ekstrahiranog uzorka RNA u ploči s jažicom26. Za umnožavanje i detekciju korišten je ABI 7500 fluorescentni kvantitativni PCR instrument u stvarnom vremenu. Sva amplifikacija nukleinske kiseline, uvjeti izvođenja PCR-a za svaki test i interpretacija rezultata provedeni su prema uputama odgovarajućeg proizvođača (Tablica 3).
U ovoj usporednoj analizi nismo upotrijebili metodu referentnog standarda za određivanje postotka slaganja (pozitivnog, negativnog i ukupnog) i drugih usporednih parametara za četiri analize. Svaka usporedba testa napravljena je s CRS-om, u ovoj studiji CRS je postavljen prema pravilu "bilo koji pozitivan" i rezultat je određen, a ne jednim testom, koristili smo najmanje dva podudarna rezultata testa. Osim toga, u slučaju prijenosa COVID-19, lažno negativni rezultati opasniji su od lažno pozitivnih. Stoga, da bismo rekli "pozitivno" što je točnije moguće na temelju rezultata CRS-a, najmanje dva testa moraju biti pozitivna, što znači da će najmanje jedan pozitivan rezultat vjerojatno doći iz EUA testa. Dakle, od četiri rezultata testa, dva ili više rezultata testa koji daju isti rezultat smatraju se istinski pozitivnima ili negativnima18,27.
Podaci su prikupljeni korištenjem strukturiranih obrazaca za izdvajanje podataka, unos i analiza podataka provedeni su pomoću statističkog softvera Excel i SPSS verzije 23.0 za deskriptivnu statistiku. Analizirani su pozitivni, negativni i ukupni postotak slaganja, a Kappa rezultat korišten je za određivanje stupnja slaganja svake metode s CRS-om. Kappa vrijednosti se tumače na sljedeći način: 0,01 do 0,20 za blago slaganje, 0,21 do 0,40 za opće slaganje, 0,41-0,60 za umjereno slaganje, 0,61-0,80 za veliko slaganje i 0,81-0,99 za potpuno slaganje28.
Etičko dopuštenje dobiveno je od strane Sveučilišta u Addis Abebi, a sve eksperimentalne protokole za ovu studiju odobrio je Odbor za reviziju znanstvene etike Etiopskog instituta za javno zdravstvo. Referentni broj za Etičku licencu EPHI je EPHI/IRB-279-2020. Sve su metode primijenjene u skladu s preporukama i odredbama Etiopskih nacionalnih sveobuhvatnih smjernica za liječenje COVID-19. Nadalje, pismeni informirani pristanak dobiven je od svih sudionika studije prije sudjelovanja u studiji.
Svi podaci dobiveni ili analizirani u ovoj studiji uključeni su u ovaj objavljeni članak. Podaci koji podupiru rezultate ove studije dostupni su od dotičnog autora na opravdan zahtjev.
Svjetska zdravstvena organizacija. Preporuke za strategije laboratorijskog testiranja na COVID-19: Privremene smjernice, 21. ožujka 2020. br. WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (WHO, 2020.).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI Pametna dijagnoza COVID-19 u odjelu hitne pomoći: Sve u praksi. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI Pametna dijagnoza COVID-19 u odjelu hitne pomoći: Sve u praksi.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. i Gurgulianis, KI Inteligentna dijagnoza COVID-19 u hitnoj službi: sve u praksi.Muliou DS, Pantazopoulos I. i Gurgulyanis KI Inteligentna dijagnoza COVID-19 u hitnim odjelima: integracija od kraja do kraja u praksi. Stručnjak velečasni Respire. lijek. 3, 263–272 (2022).
Mitchell, SL & St George, K. Procjena COVID19 ID NOW EUA testa. Mitchell, SL & St George, K. Procjena COVID19 ID NOW EUA testa.Mitchell, SL i St. George, K. Procjena COVID19 ID NOW EUA testa.Mitchell SL i St. George K. Procjena COVID19 ID NOW EUA testa. J. klinički. Virus. 128, 104429. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
WHO. Laboratorijska detekcija koronavirusne bolesti 2019 (COVID-19) kod sumnje na bolest ljudi. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (pristupljeno 15. kolovoza 2020.) (WHO, 2020.).
Udugama, B. et al. Dijagnoza COVID-19: bolesti i alati za testiranje. ACS Nano 14(4), 3822-3835 (2020).
Syed S. i sur. Osnivanje Koledža patologa istočne, središnje i južne Afrike – Regionalne škole patologije Bliskog istoka i Južne Afrike. Afrika. J. Lab. lijek. 9(1), 1-8 (2020).
Etiopski institut za javno zdravstvo, Savezno ministarstvo zdravstva. Privremena nacionalna strategija i smjernice za laboratorijsku dijagnostiku COVID-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (pristupljeno 12. kolovoza 2020.) (EPHI, 2020.).
Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Izazovi i implikacije lažno negativnih testova za infekciju SARS-CoV-2. Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Izazovi i implikacije lažno negativnih testova za infekciju SARS-CoV-2.Voloshin S., Patel N. i Kesselheim AS Lažno negativni testovi za SARS-CoV-2 infekcije i njihove posljedice.Voloshin S., Patel N. i Kesselheim AS Lažno negativni testovi za provokaciju i utjecaj infekcije SARS-CoV-2. N. inž. J. Medicina. 383(6), e38 (2020).
Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Lažno pozitivni i lažno negativni slučajevi COVID-19: Respiratorna prevencija i strategije upravljanja, cijepljenje i daljnje perspektive. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Lažno pozitivni i lažno negativni slučajevi COVID-19: Respiratorna prevencija i strategije upravljanja, cijepljenje i daljnje perspektive. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Ložnopozitivni i lošeotraženi slučajevi COVID-19: respiratorna profilaktika i strategije liječenja, vakcinacija i daljnje perspektive. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Lažno pozitivni i lažno negativni slučajevi COVID-19: respiratorna prevencija i strategije liječenja, cijepljenje i put naprijed.Muliu, DS i Gurgulianis, KI Lažno pozitivni i lažno negativni slučajevi COVID-19: strategije za respiratornu prevenciju i liječenje, cijepljenje i put naprijed. Stručnjak velečasni Respire. lijek. 15(8), 993–1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. COVID-19 dijagnoza u odjelu hitne pomoći: vidjeti drvo, ali izgubiti šumu. Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. COVID-19 dijagnoza u odjelu hitne pomoći: vidjeti drvo, ali izgubiti šumu.Mouliou, DS, Ioannis, P. i Konstantinos, G. COVID-19 dijagnoza u odjelu hitne pomoći: Vidite drvo, izgubite šumu.Muliou DS, Ioannis P. i Konstantinos G. COVID-19 dijagnoza u hitnim službama: Nema dovoljno šume za drveće. pojaviti se. lijek. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. et al. Validacija i validacija analitičke i kliničke izvedbe Abbott RealTime SARS-CoV-2 testa. J. klinički. Virus. 129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Usporedba pet setova primera iz različitih regija genoma COVID-19 za detekciju virusne infekcije konvencionalnom RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Usporedba pet skupova primera iz različitih regija genoma COVID-19 za detekciju virusne infekcije konvencionalnom RT-PCR.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. i Aflatunyan, B. Usporedba pet setova početnica iz različitih regija genoma COVID-19 za detekciju virusne infekcije konvencionalnom RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. i Aflatoonian, B. 比较来自COVID-19不同基因组区域的五个引物组，用于通过常规RT-PCR 检测病毒感染。 Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Usporedba 5 različitih genetskih regija COVID-19 za otkrivanje virusne infekcije pomoću konvencionalne RT-PCR.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neyestanaki D, Fazlalipour M. i Aflatunyan B. Usporedba pet setova početnica iz različitih regija genoma COVID-19 za detekciju virusne infekcije konvencionalnom RT-PCR.Iran. J. Mikrobiologija. 12(3), 185 (2020).
Goertzer, I. i sur. Preliminarni rezultati nacionalnog programa vanjske procjene kvalitete za detekciju sekvenci genoma SARS-CoV-2. J. klinički. Virus. 129, 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. i sur. Analitička procjena učinkovitosti pet kompleta RT-PCR za teški akutni respiratorni sindrom Coronavirus 2. J. Clinical. laboratorija. anus. 35(1), e23643 (2021).
Wang B. i sur. Procjena sedam komercijalno dostupnih kompleta za otkrivanje SARS-CoV-2 RNA u Kini na temelju lančane reakcije polimeraze (PCR) u stvarnom vremenu. klinički. Kemijski. laboratorija. lijek. 58(9), e149-e153 (2020).
van Casteren, PB et al. Usporedba sedam komercijalnih RT-PCR COVID-19 dijagnostičkih setova. J. klinički. Virus. 128, 104412 (2020).
Lu, Yu i sur. Usporedba dijagnostičke učinkovitosti dva PCR kompleta za detekciju nukleinskih kiselina SARS-CoV-2. J. klinički. laboratorija. anus. 34(10), e23554 (2020).
Lefart, PR, itd. Usporedna studija četiri SARS-CoV-2 platforme za testiranje amplifikacije nukleinske kiseline (NAAT) pokazala je da je izvedba ID NOW-a značajno smanjena ovisno o pacijentu i vrsti uzorka. dijagnoza. mikrobiologija. Zaraziti. diss. 99(1), 115200 (2021).
Abbottova molekula. Abbott umetak paketa analize SARS-CoV-2 u stvarnom vremenu. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay. 1-12 (prikaz, ostalo). (Od 10. kolovoza 2020.) (2020.).
Klein, S. i sur. SARS-CoV-2 RNA izolacija pomoću magnetskih kuglica za brzu detekciju velikih razmjera pomoću RT-qPCR i RT-LAMP. Virus 12(8), 863 (2020).