Izvedba četiri testa amplifikacije nukleinskih kiselina za identifikaciju SARS-CoV-2 u Etiopiji

Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Koristite verziju preglednika s ograničenom CSS podrškom. Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažuriranu verziju preglednika (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). Osim toga, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, stranicu prikazujemo bez stilova i JavaScripta.
Prikazuje vrtuljak s tri slajda odjednom. Koristite gumbe Prethodno i Sljedeće za pomicanje kroz tri slajda odjednom ili upotrijebite klizače na kraju za pomicanje kroz tri slajda odjednom.
Od izbijanja koronavirusne bolesti (COVID-19) 2019. godine, diljem svijeta razvijeni su mnogi komercijalni testovi amplifikacije nukleinskih kiselina (NAAT) koji su postali standardni testovi. Iako je nekoliko testova brzo razvijeno i primijenjeno u laboratorijskim dijagnostičkim testovima, njihova učinkovitost nije procijenjena u različitim okruženjima. Stoga je cilj ove studije bio procijeniti učinkovitost Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI i Sansure Biotech testova koristeći kompozitni referentni standard (CRS). Studija je provedena u Etiopskom institutu za javno zdravstvo (EPHI) od 1. do 30. prosinca 2020. 164 nazofaringealna uzorka ekstrahirana su pomoću QIAamp RNA mini kita i Abbott sustava za pripremu uzoraka DNA. Od 164 uzorka, 59,1% bilo je pozitivno, a 40,9% negativno za CRS. Pozitivna reakcija na Sansure Biotech bila je značajno niska u usporedbi s CRS-om (p < 0,05). Pozitivna reakcija na Sansure Biotech bila je značajno niska u usporedbi s CRS-om (p < 0,05). Pozitivni rezultati Sansure Biotech bili su znatno niži u usporedbi s CRS (p < 0,05). Pozitivni rezultati Sansure Biotecha bili su značajno niži u usporedbi s CRS-om (p < 0,05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低．(p < 0,05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低．(p < 0,05). U Sansure Biotechu postignuti su znatno manji pozitivni rezultati u usporedbi s CRS-om (p < 0,05). Sansure Biotech je imao značajno manje pozitivnih rezultata u usporedbi s CRS-om (p < 0,05).Ukupna podudarnost četiriju analiza bila je 96,3–100% u usporedbi s CRS-om. Osim niske stope pozitivnosti Sansure Biotech testa, učinkovitost četiriju testova bila je gotovo usporediva. Kao takav, Sansure Biotech [samo za istraživanje (RUO)] test zahtijeva dodatnu validaciju za svoju upotrebu u Etiopiji. Konačno, trebalo bi razmotriti dodatna istraživanja kako bi se procijenili testovi s odgovarajućim tvrdnjama proizvođača.
Laboratorijsko testiranje dio je Strateškog plana Svjetske zdravstvene organizacije (WHO) za pripravnost i odgovor (SPRP) na koronavirusnu bolest 2019. (COVID-19). WHO savjetuje da zemlje trebaju izgraditi laboratorijske kapacitete kako bi poboljšale pripravnost, pravilno upravljanje slučajevima, budnost i brzi odgovor na izazove javnog zdravstva. To sugerira da je uloga laboratorija ključna za karakterizaciju bolesti i epidemiologiju novih zaraznih uzročnika te kontrolu njihovog širenja.
Dijagnoza COVID-19 zahtijeva epidemiološke i medicinske informacije, osobne simptome/znakove te radiografske i laboratorijske podatke2. Otkad je izbijanje COVID-19 prijavljeno u Wuhanu u Kini, diljem svijeta razvijeni su mnogi komercijalni testovi amplifikacije nukleinskih kiselina (NAAT). Lančana reakcija polimeraze s reverznom transkripcijom u stvarnom vremenu (rRT-PCR) koristi se kao rutinska i standardna metoda za laboratorijsku dijagnozu infekcije teškim akutnim respiratornim sindromom 2 (SARS-CoV-2)3. Molekularna detekcija SARS-CoV-2 obično se temelji na genima N (gen nukleokapsidnog proteina), E (gen proteina ovojnice) i RdRp (gen RNA-ovisne RNA polimeraze) u ORF1a/b (gen otvorenog okvira za čitanje 1a/b) regiji identificiranoj iz virusnog genoma. Smatraju se glavnim konzerviranim regijama pronađenim u virusnim genomima za prepoznavanje virusa4. Među tim genima, geni RdRp i E imaju visoku analitičku osjetljivost detekcije, dok gen N ima nisku analitičku osjetljivost5.
Učinkovitost PCR testova može varirati ovisno o raznim čimbenicima kao što su: reagensi za ekstrakciju, reagensi za amplifikaciju/detekciju, metoda ekstrakcije, kvaliteta PCR uređaja i drugih instrumenata. Od travnja 2020. više od 48 različitih dijagnostičkih uređaja iz devet zemalja dobilo je Ovlaštenje za hitnu upotrebu (EUA) za dijagnostiku COVID-196. U Etiopiji se više od 14 platformi za PCR u stvarnom vremenu koristi za PCR detekciju SARS-CoV-2 u 26 javnozdravstvenih ustanova, uključujući ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 i Quant-studio7. Osim toga, dostupni su razni PCR testovi, kao što su Daan Gene test, Abbott SARS-CoV-2 test, Sansure Biotech test i SARS-CoV-2 BGI test. Iako je rRT-PCR vrlo osjetljiv, neki pacijenti s COVID-19 prijavljuju lažno negativne rezultate zbog nedovoljnog broja kopija virusne ribonukleinske kiseline (RNA) u uzorcima zbog nepravilnog prikupljanja, transporta, skladištenja i rukovanja te laboratorijskog testiranja. uvjeti i postupci osoblja8. Osim toga, pogrešno rukovanje uzorkom ili kontrolom, postavljanje praga ciklusa (Ct) i unakrsna reaktivnost s drugim patogenim nukleinskim kiselinama ili neaktivnom/rezidualnom SARS-CoV-2 RNA mogu dovesti do lažno pozitivnih rezultata u rRT-PCR9 testovima. Stoga je jasno da PCR testovi doista mogu identificirati nositelje genskih fragmenata, jer ne mogu ni razlikovati istinski aktivne virusne gene, pa testovi mogu identificirati samo nositelje, a ne i pacijente10. Stoga je važno procijeniti dijagnostičku učinkovitost korištenjem standardnih metoda u našem okruženju. Iako su mnogi NAAT reagensi dostupni u Etiopskom institutu za javno zdravstvo (EPHI) i diljem zemlje, još nije objavljena komparativna evaluacija njihove učinkovitosti. Stoga je cilj ove studije bio procijeniti komparativnu učinkovitost komercijalno dostupnih kompleta za detekciju SARS-CoV-2 rRT-PCR-om korištenjem kliničkih uzoraka.
U ovu studiju uključeno je ukupno 164 sudionika sa sumnjom na COVID-19. Većina uzoraka bila je iz centara za liječenje (118/164 = 72%), dok je preostalih 46 (28%) sudionika bilo iz centara koji nisu liječeni. Među sudionicima koji nisu liječeni u centru, 15 (9,1%) imalo je klinički sumnjive slučajeve, a 31 (18,9%) imalo je kontakte potvrđenih slučajeva. Devedeset i tri (56,7%) sudionika bili su muškarci, a prosječna (± SD) dob sudionika bila je 31,10 (± 11,82) godina.
U ovoj studiji određene su pozitivne i negativne stope četiriju testova za COVID-19. Dakle, pozitivne stope Abbott SARS-CoV-2 testa, Daan Gene 2019-nCoV testa, SARS-CoV-2 BGI testa i Sansure Biotech 2019-nCoV testa bile su 59,1%, 58,5%, 57,9% i 55,5%. Pozitivni i negativni rezultati kompozitnog referentnog standarda (CRS) bili su 97 (59,1%) i 67 (40,9%) (Tablica 1). U ovoj studiji, definicija CRS-a temeljila se na pravilu „bilo kojeg pozitivnog“, pri čemu su od četiri rezultata testa, dva ili više rezultata testa koji su dali isti rezultat smatrani istinski pozitivnima ili negativnima.
U ovoj studiji pronašli smo negativno postotno slaganje (NPA) od 100% (95% CI 94,6–100) za sve analize u usporedbi s CRS-om. Analiza Sansure Biotechnology pokazala je minimalni PPA od 93,8% (95% CI 87,2-97,1), a analiza Daan Gene 2019-nCoV imala je ukupno slaganje od 99,4% (95% CI 96,6-99,9). Nasuprot tome, ukupno slaganje između testa SARS-CoV-2 BGI i testa Sansure Biotech 2019-nCoV bilo je 98,8% odnosno 96,3% (Tablica 2).
Cohenov kappa koeficijent slaganja između rezultata CRS i Abbott SARS-CoV-2 testa bio je potpuno konzistentan (K = 1,00). Slično tome, Cohenove kappa vrijednosti detektirane pomoću Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI i Sansure Biotech 2019-nCoV također su potpuno konzistentne s CRS (K ≥ 0,925). U ovoj komparativnoj analizi, hi-kvadrat test (McNemar test) pokazao je da su se rezultati Sansure Biotech 2019-nCoV testa značajno razlikovali od rezultata CRS (p = 0,031) (Tablica 2).
Kao što je prikazano na Sl.1 postotak najniže Ct vrijednosti (< 20 Ct) Abbott SARS-CoV-2 testa (kombinirani RdRp i N gen) bio je 87,6%, a Ct vrijednost ORF1a/b gena Sansure Biotech 2019-nCoV testa pokazala je da je postotak niske Ct vrijednosti (< 20 Ct) bio 50,3%, a visoke Ct vrijednosti (36–40 Ct) 3,2%. 1 postotak najniže Ct vrijednosti (< 20 Ct) Abbott SARS-CoV-2 testa (kombinirani RdRp i N gen) bio je 87,6%, a Ct vrijednost ORF1a/b gena Sansure Biotech 2019-nCoV testa pokazala je da je postotak niske Ct vrijednosti (< 20 Ct) bio 50,3%, a visoke Ct vrijednosti (36–40 Ct) 3,2%.Kao što je prikazano na Sl.1, postotak navedenih vrijednosti Ct (< 20 Ct) analiza Abbott SARS-CoV-2 (kombinirani gen RdRp i N) iznosi 87,6%, vrijednost Ct gena ORF1a/b analiza Sansure Biotech 2019-nCoV pokazala je da postotak niskih vrijednosti Ct (< 20 Ct) iznosi 50,3%, visoka vrijednost Ct (36–40 Ct) sastavljen od 3,2%. 1, postotak najniže Ct vrijednosti (< 20 Ct) analize Abbott SARS-CoV-2 (kombinirani gen RdRp i N) bio je 87,6%, a analiza Ct vrijednosti ORF1a/b gena Sansure Biotech 2019-nCoV pokazala je da postotak niske Ct vrijednosti (< 20 Ct) čini 50,3%, a visoke Ct vrijednosti (36–40 Ct) 3,2%.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（< 20 Ct）为87,6%，Sansure Biotech 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%，高Ct 值(36-40 Ct)的百分比为3,2%。 Kao što je prikazano na slici 1, najniži postotak Ct vrijednosti (< 20 Ct) Abbott SARS-CoV-2 testa (kombinacija RdRp i N gena) iznosi 87,6%, vrijednost Ct gena ORF1a/b testa Sansure Biotech 2019-nCoV pokazuje nizak postotak Ct (< 20 Ct) od 50,3%, a postotak 高Ct (36–40 Ct) od 3,2%. Kao što je prikazano na slici 1, analiza Abbott SARS-CoV-2 (susjed gena RdRp i N) imala je samo nisku postotnu vrijednost Ct (< 20 Ct) u veličini od 87,6%, vrijednost Ct gena ORF1a/b u istraživanju Sansure Biotech 2019. – Analiza nCoV pokazala je nizak Ct. Kao što je prikazano na slici 1, Abbott SARS-CoV-2 test (kombinirajući gene RdRp i N) imao je najnižu postotnu Ct vrijednost (< 20 Ct) od 87,6%, dok je Ct vrijednost gena ORF1a/b u studiji Sansure Biotech 2019 – Analiza nCoV pokazala nisku Ct. Postotak vrijednosti (< 20 Ct) iznosio je 50,3%, a postotak visoke vrijednosti Ct (36–40 Ct) iznosio je 3,2%. Postotak vrijednosti (< 20 Ct) bio je 50,3%, a postotak visokih vrijednosti Ct (36–40 Ct) bio je 3,2%.Abbottov SARS-CoV-2 B test zabilježio je vrijednosti Ct iznad 30. S druge strane, na BGI SARS-CoV-2 testu, gen ORF1a/b imao je visoku Ct vrijednost (> 36 Ct), a postotak je bio 4% (slika 1). S druge strane, na BGI SARS-CoV-2 testu, gen ORF1a/b imao je visoku Ct vrijednost (> 36 Ct), a postotak je bio 4% (slika 1). S druge strane, u analizi BGI SARS-CoV-2 gena ORF1a/b navedeno je visoko značenje Ct (> 36 Ct), postotak koji je činio 4% (slika 1). S druge strane, u analizi BGI SARS-CoV-2 gen ORF1a/b imao je visoku Ct vrijednost (> 36 Ct), čiji je postotak bio 4% (slika 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比为4%(图1）。 S druge strane, u detekciji SARS-CoV-2 pomoću BGI, postotak gena ORF1a/b s visokom Ct vrijednošću (>36 Ct) iznosi 4% (Slika 1). S druge strane, u analizi BGI SARS-CoV-2 postotak gena ORF1a/b s visokim vrijednostima Ct (>36 Ct) iznosio je 4% (slika 1). S druge strane, u BGI SARS-CoV-2 analizi, postotak ORF1a/b gena s visokim Ct vrijednostima ​​(>36 Ct) bio je 4% (slika 1).
U ovoj studiji uzeli smo 164 nazofaringealna uzorka. Za sve vrste testova, izolacija i amplifikacija RNA provedena je korištenjem metoda i kitova koje preporučuju odgovarajući proizvođači.
Ova je studija pokazala da Abbottov test za SARS-CoV-2 ima istu učinkovitost detekcije kao i CRS, sa 100% pozitivnih, negativnih i ukupnih rezultata. Cohenova kappa podudarnost je 1,00, što ukazuje na potpuno slaganje s CRS-om. Slična studija Sveučilišta u Washingtonu u SAD-u otkrila je da je ukupna osjetljivost i specifičnost Abbottovog testa za SARS-CoV-2 bila 93% odnosno 100% u usporedbi s laboratorijski određenim testom (LDA) CDC-a. 11. Abbottov sustav za detekciju SARS-CoV-2 temelji se na istovremenoj kombiniranoj detekciji gena N i RdRp, budući da su oba gena osjetljivija, što minimizira lažno negativne rezultate12. Studija u Beču, Austrija, također je pokazala da veliki volumeni uzorka ekstrakcije i volumeni eluenta za detekciju minimiziraju učinke razrjeđivanja i povećavaju učinkovitost detekcije13. Dakle, Abbottov savršeni spoj za SARS-CoV-2 test može se povezati s platformskim sustavom za detekciju koji istovremeno detektira kombinatorne gene, ekstrahira veliki broj uzoraka (0,5 ml) i koristi veliku količinu eluenta (40 µl).
Naši rezultati su također pokazali da je učinkovitost detekcije Daan genetskog testa bila gotovo ista kao i kod CRS-a. To je u skladu sa studijom14 provedenom na Sveučilištu Anhui u Huainanu u Kini i tvrdnjom proizvođača o 100%-tnom pozitivnom slaganju. Unatoč izvješćima o dosljednim rezultatima, jedan uzorak bio je lažno negativan nakon ponovnog testiranja istog eluata, ali je bio pozitivan u testovima Abbott SARS-CoV-2 i Sansure Biotech nCoV-2019. To sugerira da može postojati varijabilnost u rezultatima među različitim vrstama testova. Ipak, u studiji provedenoj u Kini15, rezultat Daan Gene testa bio je značajno drugačiji (p < 0,05) u usporedbi s njihovim laboratorijski definiranim referentnim testom. Ipak, u studiji provedenoj u Kini15, rezultat Daan Gene testa bio je značajno drugačiji (p < 0,05) u usporedbi s njihovim laboratorijski definiranim referentnim testom. Ne manje od toga, u istraživanju provedenom u Kini15, rezultati analize Daan Gene značajno su se razlikovali (p < 0,05) od njihove laboratorijske etalon analize. Međutim, u studiji provedenoj u Kini15, rezultat analize tvrtke Daan Gene značajno se razlikovao (p < 0,05) od njihove referentne laboratorijske analize.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异＂(p < 0,05).然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Međutim, u istraživanju provedenom u Kini15, rezultati genetičkog testa Daan značajno su se razlikovali (p < 0,05) u usporedbi s njegovim etalonskim laboratorijskim testom. Međutim, u studiji provedenoj u Kini15, rezultati Daanovog genetskog testa bili su značajno drugačiji (p < 0,05) u usporedbi s testom iz referentnog laboratorija.Ova razlika može biti posljedica osjetljivosti referentnog testa za otkrivanje SARS-CoV-2, a daljnja istraživanja mogu biti važna za utvrđivanje uzroka.
Osim toga, naša je studija procijenila komparativnu učinkovitost SARS-CoV-2 BGI testa s CRS-om, pokazujući izvrstan postotak pozitivnog slaganja (PPA = 97,9%), postotak negativnog slaganja (NPA = 100%) i ukupni postotak slaganja po spolu (OPA). = 98,8%). Cohenove Kappa vrijednosti pokazale su dobro slaganje (K = 0,975). Studije u Nizozemskoj16 i Kini15 pokazale su dosljedne rezultate. SARS-CoV-2 BGI test je test detekcije jednog gena (ORF1a/b) koji koristi 10 µl eluata za amplifikaciju/detekciju. Unatoč dobrom statističkom slaganju s našim referentnim rezultatima, analiza je propustila dva pozitivna uzorka (1,22%) od ukupnog uzorka. To može imati ogromne kliničke implikacije za dinamiku prijenosa i na razini pacijenta i na razini zajednice.
Druga komparativna analiza uključena u ovu studiju bio je Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO) test; ukupni postotak podudaranja bio je 96,3%. Snaga slaganja također je određena Cohenovom Kappa vrijednošću, koja je iznosila 0,925, što ukazuje na potpuno slaganje s CRS-om. Ponovno, naši rezultati su identični studijama provedenim na Sveučilištu Central South u Changsha, Kina, i na Odjelu kliničkog laboratorija Narodne bolnice Liuzhou, grad Liuzhou, Kina17. Iako je zabilježena gore navedena dobra statistička podudarnost, hi-kvadrat test (MacNemar test) pokazao je da rezultat Sansure Biotech testa ima statistički značajnu razliku u usporedbi s CRS-om (p < 0,005). Iako je zabilježena gore navedena dobra statistička podudarnost, hi-kvadrat test (MacNemar test) pokazao je da rezultat Sansure Biotech testa ima statistički značajnu razliku u usporedbi s CRS-om (p < 0,005). Unatoč tomu da je utvrđeno da je navedeno više dobra statistička usklađenost, kriterij hi-kvadrata (kriterij Maknemara) pokazao je da rezultati analize Sansure Biotech imaju statistički značajnu razliku u usporedbi s CRS (p < 0,005). Iako je zabilježeno dobro statističko slaganje gore navedenog, hi-kvadrat test (McNemar test) pokazao je da rezultat Sansure Biotech testa ima statistički značajnu razliku u usporedbi s CRS-om (p < 0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性，但卡方检验（MacNemar 检验）表明，Sansure Biotech 检测的结果与CRS相比具有统计学显着差异＂ (p < 0,005).尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（macnemar 检验 表明 ， ， sansure biotech 检测 结果与 crs 相比 具有 显着 （（(p <0,005。。。。。。。。。。。。。。。。。。）))) Bez obzira na to što je istaknuto više dobra statistička usklađenost, kriterij hi-kvadrata (kriterij Maknemara) pokazao je statistički značajnu razliku (p < 0,005) između analize Sansure Biotech i CRS. Unatoč dobrom statističkom slaganju navedenom gore, hi-kvadrat test (McNemar test) pokazao je statistički značajnu razliku (p < 0,005) između Sansure Biotech testa i CRS-a.Šest uzoraka (3,66%) pokazalo se lažno negativnim u usporedbi s CRS-om (Dodatna tablica 1); to je vrlo važno, posebno s obzirom na dinamiku prijenosa virusa. Gore navedeni podaci također podupiru ovu nisku stopu detekcije15.
U ovoj studiji, Ct vrijednosti su određene za svaki test i odgovarajuću platformu, s najnižom srednjom Ct vrijednošću zabilježenom u Abbott SARS-CoV-2 testu. Ovaj rezultat može biti povezan s Abbottovim simultanim kombiniranim genetskim sustavom testiranja za detekciju SARS-CoV-2. Stoga, prema slici 1, 87,6% Abbott SARS-CoV-2 rezultata imalo je Ct vrijednosti ispod 20. Samo mali broj rezultata uzoraka (12,4%) bio je u rasponu od 20-30. Ct vrijednosti iznad 30 nisu zabilježene. Osim Abbottove upotrebe formata genetskog testiranja panela SARS-CoV-2, ovaj rezultat može biti povezan s donjom granicom detekcije (32,5 RNA kopija/mL)18, što je tri puta niže od donje granice tvrtke od 100 RNA kopija/mL (ml)19.
Ova studija ima neka ograničenja: prvo, nemamo standardne/referentne metode [kao što su virusno opterećenje ili drugi laboratorijski testovi (LDA)] zbog nedostatka resursa. Drugo, svi uzorci korišteni u ovoj studiji bili su nazofaringealni brisevi, dok rezultati nisu bili primjenjivi na druge vrste uzoraka, i treće, veličina našeg uzorka bila je mala.
Ova studija usporedila je učinkovitost četiri rRT-PCR testa za SARS-CoV-2 korištenjem uzoraka iz nazofarinksa. Svi testovi detekcije imali su gotovo usporedive performanse, s izuzetkom testa Sansure Biotech. Osim toga, u Sansure Biotech testu utvrđena je niska stopa pozitivnosti u usporedbi s CRS-om (p < 0,05). Osim toga, u Sansure Biotech testu utvrđena je niska stopa pozitivnosti u usporedbi s CRS-om (p < 0,05). Osim toga, u testu Sansure Biotech zabilježen je nizak postotak pozitivnih rezultata u usporedbi s CRS (p < 0,05). Osim toga, Sansure Biotech test pokazao je nizak postotak pozitivnih rezultata u usporedbi s CRS-om (p < 0,05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低 (p < 0,05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低 (p < 0,05). Osim toga, analiza Sansure Biotech dala je niži stupanj pozitivnih rezultata u usporedbi s CRS (p < 0,05). Osim toga, Sansure Biotech test imao je nižu stopu pozitivnosti u usporedbi s CRS-om (p < 0,05).Analiza PPA, NPA i ukupne slaganja tvrtke Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) premašila je 93,5% s vrijednošću Cohen Kappa jačine slaganja od 0,925. Konačno, Sansure Biotech Assay (RUO) treba daljnju validaciju za upotrebu u Etiopiji, a trebalo bi razmotriti i dodatna istraživanja kako bi se procijenile tvrdnje pojedinačnih proizvođača.
Usporedna studija provedena je u četiri zdravstvene ustanove u Addis Abebi: bolnici Eka Kotebe, centru za liječenje Millennium Church, memorijalnoj bolnici Zewooditu i specijalističkoj bolnici za tuberkulozu sv. Petra. Podaci su prikupljeni između 1. i 31. prosinca 2020. Medicinske ustanove za ovu studiju odabrane su namjerno zbog velikog broja slučajeva i dostupnosti većih centara za liječenje u gradu. Slično tome, instrumenti, uključujući instrumente za PCR u stvarnom vremenu ABI 7500 i Abbott m2000, odabrani su prema preporukama proizvođača NAAT reagensa, a za ovu studiju odabrana su četiri PCR detekcijska kompleta, budući da je većina laboratorija u Etiopiji koristila barem četiri od njih. Genski test, Abbott SARS-CoV-2 test, Sansure Biotech test i SARS-CoV-2 BGI test provedeni su tijekom studije.
Testiranje na SARS-CoV-2 provedeno je od 1. do 30. prosinca 2020. korištenjem 3 ml virusnog transportnog medija (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, Kina) od osoba pod istragom na COVID-19 upućenih u EPHI. Uzorke nazofarinksa prikupili su obučeni sakupljači uzoraka i poslali u EPHI u trostrukim pakiranjima. Prije izolacije nukleinske kiseline, svakom uzorku dodjeljuje se jedinstveni identifikacijski broj. Ekstrakcija se provodi iz svakog uzorka odmah po dolasku korištenjem ručnih i automatskih metoda ekstrakcije. Dakle, za automatsku ekstrakciju Abbott m2000, 1,3 ml (uključujući 0,8 ml mrtvog volumena i 0,5 ml ulaznog volumena ekstrakcije) uzorka ekstrahirano je iz svakog uzorka i propušteno kroz Abbott DNA Sample Preparation System (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, SAD). ) Serija od 96 [92 uzorka, dvije kontrole detekcije i dvije kontrole bez predloška (NTC)] uključena je u cjelokupni proces (preuzimanje i detekcija) dva kruga SARS-CoV-2 (EUA) u stvarnom vremenu. rudarenje. Slično tome, za ručnu ekstrakciju koristite iste uzorke (za automatsku ekstrakciju i otkrivanje). Dakle, tijekom cijelog procesa, 140 µl uzoraka je alikvotirano i ekstrahirano pomoću QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Njemačka) u serijama od 24 (uključujući 20 uzoraka, dvije kontrole testa i dva NTC-a) tijekom devet krugova. Ručno ekstrahirani eluati su amplificirani i detektirani pomoću ABI 7500 termalnog ciklera koristeći SARS-CoV-2 BGI test, Daan Gene test i Sansure Biotech test.
Automatizirana izolacija i pročišćavanje virusne RNA SARS-CoV-2 slijedi princip magnetskih kuglica korištenjem Abbott reagensa za pripremu uzoraka DNA. Inaktivacija uzoraka i solubilizacija virusnih čestica provodi se pomoću deterdženta koji sadrži gvanidin izotiocijanat za denaturaciju proteina i inaktivaciju RNaze. RNA se zatim odvaja od proteina odvajanjem na čvrstoj fazi pomoću silicija, tj. gvanidinijeva sol i alkalni pH pufera za lizu potiču vezanje nukleinskih kiselina na silicijev dioksid (SiO2). Korak ispiranja uklanja preostale proteine ​​i ostatke kako bi se dobila bistra otopina. Transparentna RNA se izolira iz mikročestica na bazi silicija pomoću magnetskog polja instrumenta20,21. S druge strane, ručna izolacija i pročišćavanje RNA provodi se metodom spin kolone korištenjem centrifugiranja umjesto magnetskog stalka i odvajanja mikročestica od eluenta.
Abbott test detekcije SARS-CoV-2 u stvarnom vremenu (Abbott Molecular, Inc.) proveden je prema uputama proizvođača, koji je primio EUA19,22 od WHO-a i FDA-e. U ovom protokolu, inaktivacija uzorka prije ekstrakcije provedena je u vodenoj kupelji na 56 °C tijekom 30 minuta. Nakon inaktivacije virusa, ekstrakcija nukleinske kiseline provedena je na Abbott m2000 SP instrumentu iz 0,5 ml VTM-a korištenjem Abbott m2000 sustava za pripremu uzoraka DNA, prema uputama proizvođača. Amplifikacija i detekcija provedene su pomoću Abbott m2000 RT-PCR instrumenta, a dvostruka detekcija provedena je za gene RdRp i N. ROX) i VIC P (vlasnička boja) za ciljanje i detekciju unutarnjih kontrola, omogućujući istovremenu detekciju oba produkta amplifikacije 19.
Metoda detekcije amplifikacije ovog kita temelji se na RT-PCR tehnologiji u jednom koraku. Geni ORF1a/b i N odabrani su kao konzervirane regije tvrtke Daan Gene Technology za detekciju amplifikacije ciljne regije. Specifični primeri i fluorescentne probe (probe N gena označene s FAM, probe ORF1a/b označene s VIC) dizajnirani su za detekciju SARS-CoV-2 RNA u uzorcima. Konačni eluent i glavne smjese pripremljeni su dodavanjem 5 µl eluenta u 20 µl glavne smjese do konačnog volumena od 25 µl. Amplifikacija i detekcija provedene su istovremeno na ABI 750024 instrumentu za PCR u stvarnom vremenu.
ORF1a/b i N geni detektirani su pomoću Sansure Biotech nCoV-2019 Nucleic Acid Diagnostic Kita (fluorescentna PCR detekcija). Pripremite specifične probe za svaki ciljni gen odabirom FAM kanala za ORF1a/b regiju i ROX kanala za N gen. U ovaj testni kit dodaju se eluent i master mix reagensi na sljedeći način: pripremite 30 µl master mix reagensa i 20 µl eluiranog uzorka za detekciju/amplifikaciju. Za amplifikaciju/detekciju korišten je Real-time PCR ABI 750025.
SARS-CoV-2 BGI test je fluorescentni komplet za rRT-PCR u stvarnom vremenu za dijagnozu COVID-19. Ciljna regija nalazi se u ORF1a/b regiji genoma SARS-CoV-2, što je metoda detekcije jednog gena. Osim toga, ljudski kućni gen β-aktin je interno regulirani ciljni gen. Master mix se priprema miješanjem 20 µl reagensa master mixa i 10 µl ekstrahiranog uzorka RNA u pločici s jažicama26. Za amplifikaciju i detekciju korišten je ABI 7500 fluorescentni kvantitativni instrument za PCR u stvarnom vremenu. Sva amplifikacija nukleinskih kiselina, uvjeti PCR-a za svaki test i interpretacija rezultata provedeni su prema uputama proizvođača (Tablica 3).
U ovoj komparativnoj analizi nismo koristili metodu referentnog standarda za određivanje postotka slaganja (pozitivno, negativno i ukupno) i ostalih parametara usporedbe za četiri analize. Svaka usporedba testova provedena je s CRS-om, u ovoj studiji CRS je postavljen prema pravilu „bilo koji pozitivan“ i rezultat je određen, a ne jednim testom, koristili smo barem dva usklađena rezultata testa. Osim toga, u slučaju prijenosa COVID-19, lažno negativni rezultati su opasniji od lažno pozitivnih rezultata. Stoga, da bi se što točnije reklo „pozitivno“ iz rezultata CRS-a, barem dva testa moraju biti pozitivna, što znači da barem jedan pozitivan rezultat vjerojatno dolazi iz EUA testa. Dakle, od četiri rezultata testa, dva ili više rezultata testa koji daju isti rezultat smatraju se istinski pozitivnima ili negativnima18,27.
Podaci su prikupljeni korištenjem strukturiranih obrazaca za ekstrakciju podataka, unos i analiza podataka provedeni su korištenjem statističkog softvera Excel i SPSS verzije 23.0 za deskriptivnu statistiku. Analizirani su pozitivni, negativni i ukupni postotak slaganja, a Kappa rezultat korišten je za određivanje stupnja slaganja svake metode s CRS-om. Kappa vrijednosti interpretiraju se na sljedeći način: 0,01 do 0,20 za blago slaganje, 0,21 do 0,40 za opće slaganje, 0,41-0,60 za umjereno slaganje, 0,61-0,80 za veliko slaganje i 0,81-0,99 za potpuno slaganje28.
Etičko odobrenje dobiveno je od Sveučilišta u Addis Abebi, a sve eksperimentalne protokole za ovu studiju odobrio je Odbor za znanstvenu etiku Etiopskog instituta za javno zdravstvo. Referentni broj etičke licence EPHI-ja je EPHI/IRB-279-2020. Sve metode primijenjene su u skladu s preporukama i odredbama Etiopskih nacionalnih sveobuhvatnih smjernica za liječenje COVID-19. Osim toga, prije sudjelovanja u studiji dobiven je pisani informirani pristanak svih sudionika studije.
Svi podaci dobiveni ili analizirani u ovoj studiji uključeni su u ovaj objavljeni članak. Podaci koji podupiru rezultate ove studije dostupni su od odgovarajućeg autora na razuman zahtjev.
Svjetska zdravstvena organizacija. Preporuke za strategije laboratorijskog testiranja za COVID-19: Privremene smjernice, 21. ožujka 2020. br. WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (WHO, 2020).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. i Gourgoulianis, KI Pametna dijagnoza COVID-19 u hitnoj službi: Sve u praksi. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. i Gourgoulianis, KI Pametna dijagnoza COVID-19 u hitnoj službi: Sve u praksi.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. i Gurgulianis, KI Inteligentna dijagnoza COVID-19 u hitnoj službi: sve u praksi.Muliou DS, Pantazopoulos I. i Gurgulyanis KI Inteligentna dijagnoza COVID-19 u hitnim odjelima: integracija od početka do kraja u praksi. Stručnjak Reverend Respire. medicina. 3, 263–272 (2022).
Mitchell, SL i St George, K. Evaluacija COVID19 ID NOW EUA testa. Mitchell, SL i St George, K. Evaluacija COVID19 ID NOW EUA testa.Mitchell, SL i St. George, K. Evaluacija COVID19 ID NOW EUA testa.Mitchell SL i St. George K. Evaluacija COVID19 ID NOW EUA testa. J. Clinical. Virus. 128, 104429. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
WHO. Laboratorijsko otkrivanje koronavirusne bolesti 2019 (COVID-19) kod ljudi za koje se sumnja da su bolesni. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (pristupljeno 15. kolovoza 2020.) (WHO, 2020.).
Udugama, B. i dr. Dijagnoza COVID-19: Bolesti i alati za testiranje. ACS Nano 14(4), 3822–3835 (2020).
Syed S. i dr. Osnivanje Koledža patologa istočne, središnje i južne Afrike – Regionalne škole patologije Bliskog istoka i Južne Afrike. Afrika. J. Lab. medicine. 9(1), 1-8 (2020).
Etiopski institut za javno zdravstvo, Savezno ministarstvo zdravstva. Privremena nacionalna strategija i smjernice za laboratorijsku dijagnostiku COVID-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (pristupljeno 12. kolovoza 2020.) (EPHI, 2020.).
Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Lažno negativni testovi za infekciju SARS-CoV-2 izazovi i implikacije. Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Lažno negativni testovi za infekciju SARS-CoV-2 izazovi i implikacije.Voloshin S., Patel N. i Kesselheim AS Lažno negativni testovi za infekcije SARS-CoV-2 i njihove posljedice.Voloshin S., Patel N. i Kesselheim AS Lažno negativni testovi za provokaciju i utjecaj infekcije SARS-CoV-2. N. eng. J. Medicine. 383(6), e38 (2020).
Mouliou, DS i Gourgoulianis, KI Lažno pozitivni i lažno negativni slučajevi COVID-19: Strategije respiratorne prevencije i liječenja, cijepljenje i daljnje perspektive. Mouliou, DS i Gourgoulianis, KI Lažno pozitivni i lažno negativni slučajevi COVID-19: Strategije respiratorne prevencije i liječenja, cijepljenje i daljnje perspektive. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Ložnopozitivni i lošetrajni slučajevi COVID-19: respiratorna profilaktika i strategije liječenja, vakcinacija i daljnje perspektive. Mouliou, DS i Gourgoulianis, KI Lažno pozitivni i lažno negativni slučajevi COVID-19: strategije respiratorne prevencije i liječenja, cijepljenje i put naprijed.Muliu, DS i Gurgulianis, KI Lažno pozitivni i lažno negativni slučajevi COVID-19: strategije za respiratornu prevenciju i liječenje, cijepljenje i put naprijed. Stručnjak Reverend Respire. medicina. 15(8), 993–1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. i Konstantinos, G. Dijagnoza COVID-19 na odjelu hitne pomoći: Vidjeti drvo, ali izgubiti šumu. Mouliou, DS, Ioannis, P. i Konstantinos, G. Dijagnoza COVID-19 na odjelu hitne pomoći: Vidjeti drvo, ali izgubiti šumu.Mouliou, DS, Ioannis, P. i Konstantinos, G. Dijagnoza COVID-19 u hitnoj službi: Vidi drvo, izgubi šumu.Muliou DS, Ioannis P. i Konstantinos G. Dijagnoza COVID-19 u hitnim službama: Nema dovoljno šume za drveće. Appear. medicine. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. i dr. Validacija i validacija analitičke i kliničke učinkovitosti Abbott RealTime SARS-CoV-2 testa. J. Clinical. Virus. 129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Usporedba pet setova primera iz različitih regija genoma COVID-19 za detekciju virusne infekcije konvencionalnom RT-PCR metodom. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Usporedba pet setova primera iz različitih regija genoma COVID-19 za detekciju virusne infekcije konvencionalnom RT-PCR metodom.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. i Aflatunyan, B. Usporedba pet setova primera iz različitih regija genoma COVID-19 za detekciju virusne infekcije konvencionalnom RT-PCR metodom. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. i Aflatoonian, B. 比较来自COVID-19不同基因组区域的五个引物组，用于通过常规RT-PCR 检测病毒感染。 Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Usporedba 5 različitih genetskih regija COVID-19 za otkrivanje virusne infekcije konvencionalnom RT-PCR-om.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neyestanaki D, Fazlalipour M. i Aflatunyan B. Usporedba pet setova primera iz različitih regija genoma COVID-19 za detekciju virusne infekcije konvencionalnom RT-PCR metodom.Iran. Časopis za mikrobiologiju. 12(3), 185 (2020).
Goertzer, I. i dr. Preliminarni rezultati nacionalnog programa vanjske procjene kvalitete za otkrivanje genomskih sekvenci SARS-CoV-2. J. Clinical. Virus. 129, 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. i dr. Analitička evaluacija učinkovitosti pet RT-PCR kompleta za teški akutni respiratorni sindrom uzrokovan koronavirusom 2. J. Clinical. laboratory. anus. 35(1), e23643 (2021).
Wang B. i dr. Evaluacija sedam komercijalno dostupnih kompleta za detekciju RNA SARS-CoV-2 u Kini temeljenih na lančanoj reakciji polimeraze (PCR) u stvarnom vremenu. klinička. kemijska. laboratorijska. medicina. 58(9), e149–e153 (2020).
van Casteren, PB i dr. Usporedba sedam komercijalnih RT-PCR dijagnostičkih kompleta za COVID-19. J. Clinical. Virus. 128, 104412 (2020).
Lu, Yu i dr. Usporedba dijagnostičkih performansi dvaju PCR kitova za detekciju nukleinskih kiselina SARS-CoV-2. J. Clinical. laboratory. anus. 34(10), e23554 (2020).
Lefart, PR, itd. Komparativna studija četiriju platformi za testiranje amplifikacije nukleinskih kiselina (NAAT) SARS-CoV-2 pokazala je da su performanse ID NOW značajno smanjene ovisno o pacijentu i vrsti uzorka. dijagnoza. mikrobiologija. Infect. diss. 99(1), 115200 (2021).
Abbottova molekula. Abbottova uputa o pakiranju za analizu SARS-CoV-2 u stvarnom vremenu. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay. 1-12. (Od 10. kolovoza 2020.) (2020.).
Klein, S. i dr. Izolacija RNA SARS-CoV-2 pomoću magnetskih kuglica za brzo otkrivanje velikih razmjera RT-qPCR-om i RT-LAMP-om. Virus 12(8), 863 (2020).