Faktori smetnji u PCR reakcijama

Tijekom reakcije PCR -a često se susreću neki ometajući faktori.
Zbog vrlo visoke osjetljivosti PCR -a, zagađenje se smatra jednim od najvažnijih čimbenika koji utječu na rezultate PCR -a i može dati lažno pozitivne rezultate.
Jednako su kritični različiti izvori koji dovode do lažno negativnih rezultata. Ako se jedan ili više bitnih dijelova PCR smjese ili sama reakcija pojačanja inhibiraju ili ometaju, dijagnostički test može se ometati. To može dovesti do smanjene učinkovitosti, pa čak i lažnih negativnih rezultata.
Pored inhibicije, može se dogoditi gubitak integriteta ciljane nukleinske kiseline zbog uvjetima otpreme i/ili skladištenja prije pripreme uzorka. Konkretno, visoke temperature ili neadekvatno skladištenje mogu dovesti do oštećenja stanica i nukleinskih kiselina. Fiksacija stanica i tkiva i ugradnja parafina dobro su poznati uzroci fragmentacije DNK i trajni problem (vidi slike 1 i 2). U tim slučajevima čak i optimalna izolacija i pročišćavanje neće pomoći.

Slika 1 | Učinak imobilizacije na integritet DNK
Elektroforeza agaroznog gela pokazala je da se kvaliteta DNK izolira iz parafinskih dijelova obdukcije znatno varirala. DNA različitih prosječnih duljina fragmenta bila je prisutna u ekstraktima, ovisno o metodi fiksacije. DNK je sačuvana samo kad je fiksirana u nativnim smrznutim uzorcima i u puferiranom neutralnom formalinu. Upotreba snažno kiselog bouinovog fiksata ili nepušenog formalina koja sadrži mravlje kiseline rezultirala je značajnim gubitkom DNK. Preostala frakcija je vrlo fragmentirana.
S lijeve strane, duljina fragmenata izražava se u parovima kilobaze (KBP)

Slika 2 | Gubitak integriteta ciljeva nukleinske kiseline
(a) Jaz od 3 '-5' na oba pramenova rezultirat će prekidom ciljanog DNK. Sinteza DNK i dalje će se pojaviti na malom fragmentu. Međutim, ako na fragmentu DNK nedostaje mjesto za žarenje, dođe do samo linearnog pojačanja. U najpovoljnijem slučaju, fragmenti se mogu međusobno reziturirati, ali prinosi će biti mali i ispod razine detekcije.
(b) Gubitak baza, uglavnom zbog depurine i stvaranja dimera timidina, dovodi do smanjenja broja H-veza i smanjenja TM. Tijekom izdužene faze zagrijavanja, primeri će se rastopiti od matrične DNK i neće se žaliti ni pod manje strogim uvjetima.
(c) susjedne baze timina tvore TT dimer.
Drugi uobičajeni problem koji se često javlja u molekularnoj dijagnostici je manje od optimalnog oslobađanja ciljnih nukleinskih kiselina u usporedbi s ekstrakcijom fenol-kloroforma. U ekstremnim slučajevima to se može povezati s lažnim negativima. Mnogo se vremena može uštedjeti ključanjem lize ili enzimske probave staničnih krhotina, ali ova metoda često rezultira niskom osjetljivošću na PCR zbog nedovoljnog oslobađanja nukleinske kiseline.

Inhibicija aktivnosti polimeraze tijekom pojačanja

Općenito, inhibicija se koristi kao koncept spremnika za opisivanje svih čimbenika koji dovode do suboptimalnih rezultata PCR -a. U strogo biokemijskom smislu, inhibicija je ograničena na aktivnost enzima, tj. Smanjuje ili sprječava pretvorbu supstrata kroz interakciju s aktivnim mjestom DNA polimeraze ili njegovim kofaktorom (npr. Mg2+ za Taq DNA polimerazu).
Komponente u uzorku ili različitim puferima i ekstraktima koji sadrže reagense mogu izravno inhibirati enzim ili zarobiti svoje kofaktore (npr. EDTA), čime inaktivira polimerazu i zauzvrat što dovodi do smanjenih ili lažnih negativnih rezultata PCR -a.
Međutim, mnoge interakcije između reakcijskih komponenti i nukleinskih kiselina koje sadrže ciljeve također su označene kao "PCR inhibitori". Jednom kada se integritet stanice poremeti izolacijom i oslobađa se nukleinska kiselina, mogu se pojaviti interakcije između uzorka i okolne otopine i čvrste faze. Na primjer, 'čistači' mogu vezati jedno- ili dvolančanu DNK kroz nekovalentne interakcije i ometati izolaciju i pročišćavanje smanjujući broj ciljeva koji na kraju dosegnu PCR reakcijsku posudu.
Općenito, inhibitori PCR -a prisutni su u većini tjelesnih tekućina i reagensa koji se koriste za klinička dijagnostička ispitivanja (urea u urinu, hemoglobinu i heparinu u krvi), dodacima prehrani (organske komponente, glikogen, masti, ca2+ ioni) i komponente u okolišu (fenol, teški metali)

Prethodni PCR inhibitori mogu se naći u bakterijama i eukariotskim stanicama, neciljanom DNK, makromolekulama matrica tkiva i laboratorijskom opremom, poput rukavica i plastike. Pročišćavanje nukleinskih kiselina tijekom ili nakon ekstrakcije preferirana je metoda za uklanjanje PCR inhibitora.
Danas razna oprema za automatiziranu ekstrakciju može zamijeniti mnoge ručne protokole, ali 100% oporavak i/ili pročišćavanje ciljeva nikada nije postignut. Potencijalni inhibitori još uvijek mogu biti prisutni u pročišćenim nukleinskim kiselinama ili su možda već stupili na snagu. Postoje različite strategije za smanjenje utjecaja inhibitora. Izbor odgovarajuće polimeraze može imati značajan utjecaj na aktivnost inhibitora. Ostale dokazane metode za smanjenje inhibicije PCR povećavaju koncentraciju polimeraze ili primjene aditiva poput BSA.
Inhibicija PCR reakcija može se pokazati primjenom unutarnje kontrole kvalitete procesa (IPC).
Mora se paziti za uklanjanje svih reagensa i drugih otopina u kompletu za ekstrakciju, kao što su etanol, EDTA, CETAB, LiCL, GUSCN, SDS, izopropanol i fenol, iz izolata nukleinske kiseline temeljitim korakom pranja. Ovisno o njihovoj koncentraciji, oni mogu aktivirati ili inhibirati PCR.