Interferencijski faktori u PCR reakcijama

Tijekom PCR reakcije često se susreću neki interferirajući faktori.
Zbog vrlo visoke osjetljivosti PCR-a, kontaminacija se smatra jednim od najvažnijih čimbenika koji utječu na rezultate PCR-a i može dati lažno pozitivne rezultate.
Jednako su kritični različiti izvori koji dovode do lažno negativnih rezultata. Ako su jedan ili više bitnih dijelova PCR smjese ili same reakcije amplifikacije inhibirani ili ometani, dijagnostički test može biti otežan. To može dovesti do smanjene učinkovitosti, pa čak i lažno negativnih rezultata.
Osim inhibicije, gubitak integriteta ciljne nukleinske kiseline može se dogoditi zbog uvjeta transporta i/ili skladištenja prije pripreme uzorka. Posebno, visoke temperature ili neadekvatno skladištenje mogu dovesti do oštećenja stanica i nukleinskih kiselina. Fiksacija stanica i tkiva te ugradnja u parafin dobro su poznati uzroci fragmentacije DNK i trajni problem (vidi slike 1 i 2). U tim slučajevima, čak ni optimalna izolacija i pročišćavanje neće pomoći.

Slika 1 | Učinak imobilizacije na integritet DNK
Elektroforeza na agaroznom gelu pokazala je da kvaliteta DNA izolirane iz parafinskih presjeka autopsija znatno varira. DNA različitih prosječnih duljina fragmenata bila je prisutna u ekstraktima ovisno o metodi fiksacije. DNA je sačuvana samo kada je fiksirana u nativnim smrznutim uzorcima i u puferiranom neutralnom formalinu. Upotreba jako kiselog Bouinova fiksativa ili nepuferiranog formalina koji sadrži mravlju kiselinu rezultirala je značajnim gubitkom DNA. Preostala frakcija je visoko fragmentirana.
S lijeve strane, duljina fragmenata izražena je u kilobaznim parovima (kbp)

Slika 2 | Gubitak integriteta meta nukleinskih kiselina
(a) Razmak od 3′-5′ na oba lanca rezultirat će prekidom u ciljnoj DNA. sinteza DNA će se i dalje odvijati na malom fragmentu. Međutim, ako na fragmentu DNA nedostaje mjesto vezanja primera, događa se samo linearna amplifikacija. U najpovoljnijem slučaju, fragmenti se mogu ponovno zasititi, ali prinosi će biti mali i ispod razina detekcije.
(b) Gubitak baza, uglavnom zbog depurinacije i stvaranja timidinskog dimera, dovodi do smanjenja broja H-veza i smanjenja Tm. Tijekom produljene faze zagrijavanja, primeri će se otopiti od matrične DNA i neće se vezati čak ni pod manje strogim uvjetima.
(c) Susjedne timinske baze tvore TT dimer.
Drugi česti problem koji se često javlja u molekularnoj dijagnostici je manje optimalno oslobađanje ciljnih nukleinskih kiselina u usporedbi s ekstrakcijom fenol-kloroformom. U ekstremnim slučajevima to može biti povezano s lažno negativnim rezultatima. Mnogo vremena može se uštedjeti kuhanjem ili enzimskom digestijom staničnog otpada, ali ova metoda često rezultira niskom osjetljivošću PCR-a zbog nedovoljnog oslobađanja nukleinske kiseline.

Inhibicija aktivnosti polimeraze tijekom amplifikacije

Općenito, inhibicija se koristi kao kontejnerski koncept za opisivanje svih čimbenika koji dovode do suboptimalnih rezultata PCR-a. U strogo biokemijskom smislu, inhibicija je ograničena na aktivnost enzima, tj. smanjuje ili sprječava pretvorbu supstrata u produkt interakcijom s aktivnim mjestom DNA polimeraze ili njezinim kofaktorom (npr. Mg2+ za Taq DNA polimerazu).
Komponente u uzorku ili razni puferi i ekstrakti koji sadrže reagense mogu izravno inhibirati enzim ili vezati njegove kofaktore (npr. EDTA), čime se inaktivira polimeraza i zauzvrat dovodi do smanjenih ili lažno negativnih PCR rezultata.
Međutim, mnoge interakcije između reakcijskih komponenti i nukleinskih kiselina koje sadrže mete također se nazivaju 'inhibitorima PCR-a'. Nakon što se integritet stanice poremeti izolacijom i nukleinska kiselina se oslobodi, mogu se dogoditi interakcije između uzorka i okolne otopine te čvrste faze. Na primjer, 'hvatači' mogu vezati jednolančanu ili dvolančanu DNA putem nekovalentnih interakcija i ometati izolaciju i pročišćavanje smanjenjem broja meta koje na kraju dospiju u PCR reakcijsku posudu.
Općenito, PCR inhibitori prisutni su u većini tjelesnih tekućina i reagensa koji se koriste za kliničke dijagnostičke testove (urea u urinu, hemoglobin i heparin u krvi), dodacima prehrani (organske komponente, glikogen, masti, Ca2+ ioni) i komponentama u okolišu (fenoli, teški metali).

Češći PCR inhibitori mogu se naći u bakterijama i eukariotskim stanicama, neciljnoj DNA, makromolekulama tkivnih matrica koje vežu DNA i laboratorijskoj opremi poput rukavica i plastike. Pročišćavanje nukleinskih kiselina tijekom ili nakon ekstrakcije je preferirana metoda za uklanjanje PCR inhibitora.
Danas, razna automatizirana oprema za ekstrakciju može zamijeniti mnoge ručne protokole, ali 100%-tno oporavka i/ili pročišćavanja ciljeva nikada nije postignuto. Potencijalni inhibitori mogu još uvijek biti prisutni u pročišćenim nukleinskim kiselinama ili su možda već stupili na snagu. Postoje različite strategije za smanjenje utjecaja inhibitora. Izbor odgovarajuće polimeraze može imati značajan utjecaj na aktivnost inhibitora. Druge dokazane metode za smanjenje inhibicije PCR-a su povećanje koncentracije polimeraze ili primjena aditiva poput BSA.
Inhibicija PCR reakcija može se dokazati korištenjem interne kontrole kvalitete procesa (IPC).
Potrebno je paziti da se svi reagensi i ostale otopine iz kompleta za ekstrakciju, poput etanola, EDTA, CETAB-a, LiCl-a, GuSCN-a, SDS-a, izopropanola i fenola, uklone iz izolata nukleinske kiseline temeljitim ispiranjem. Ovisno o njihovoj koncentraciji, mogu aktivirati ili inhibirati PCR.