Čimbenici interferencije u PCR reakcijama

Tijekom PCR reakcije često se susreću neki ometajući čimbenici.
Zbog vrlo visoke osjetljivosti PCR-a, kontaminacija se smatra jednim od najvažnijih čimbenika koji utječu na rezultate PCR-a i može proizvesti lažno pozitivne rezultate.
Jednako su kritični različiti izvori koji dovode do lažno negativnih rezultata. Ako su jedan ili više bitnih dijelova PCR smjese ili sama reakcija amplifikacije inhibirani ili ometani, dijagnostički test može biti ometan. To može dovesti do smanjene učinkovitosti, pa čak i do lažno negativnih rezultata.
Uz inhibiciju, može doći do gubitka integriteta ciljne nukleinske kiseline zbog uvjeta transporta i/ili skladištenja prije pripreme uzorka. Konkretno, visoke temperature ili neadekvatno skladištenje mogu dovesti do oštećenja stanica i nukleinskih kiselina. Fiksacija stanica i tkiva te ugradnja parafina dobro su poznati uzroci fragmentacije DNA i stalni problem (vidi slike 1 i 2). U tim slučajevima čak ni optimalna izolacija i pročišćavanje neće pomoći.

Slika 1 | Učinak imobilizacije na integritet DNK
Elektroforeza u agaroznom gelu pokazala je da je kvaliteta DNK izolirane iz parafinskih dijelova obdukcija znatno varirala. U ekstraktima je bila prisutna DNA različitih prosječnih duljina fragmenata ovisno o metodi fiksacije. DNK je sačuvana samo kada je fiksirana u nativnim smrznutim uzorcima i u puferiranom neutralnom formalinu. Upotreba jako kiselog Bouin fiksativa ili nepuferiranog formalina koji sadrži mravlju kiselinu rezultirala je značajnim gubitkom DNK. Preostala frakcija je jako fragmentirana.
S lijeve strane, duljina fragmenata izražena je u parovima kilobaza (kbp)

Slika 2 | Gubitak integriteta ciljeva nukleinskih kiselina
(a) Razmak od 3'-5' na oba lanca rezultirat će prekidom u ciljnoj DNK. sinteza DNA će se i dalje događati na malom fragmentu. Međutim, ako na fragmentu DNA nedostaje mjesto žarenja primera, dolazi samo do linearnog pojačanja. U najpovoljnijem slučaju, fragmenti mogu ponovno zasititi jedni druge, ali će prinosi biti mali i ispod razina detekcije.
(b) Gubitak baza, uglavnom zbog depurinacije i stvaranja dimera timidina, dovodi do smanjenja broja H-veza i smanjenja Tm. Tijekom produžene faze zagrijavanja, početnice će se rastaliti od matrične DNK i neće se žariti čak ni pod manje strogim uvjetima.
(c) Susjedne timinske baze tvore TT dimer.
Još jedan uobičajeni problem koji se često javlja u molekularnoj dijagnostici je manje od optimalnog otpuštanja ciljnih nukleinskih kiselina u usporedbi s ekstrakcijom fenol-kloroformom. U ekstremnim slučajevima, to može biti povezano s lažno negativnim rezultatima. Mnogo se vremena može uštedjeti lizom kuhanjem ili enzimskom probavom staničnih ostataka, ali ova metoda često rezultira niskom PCR osjetljivošću zbog nedovoljnog oslobađanja nukleinske kiseline.

Inhibicija aktivnosti polimeraze tijekom amplifikacije

Općenito, inhibicija se koristi kao koncept spremnika za opisivanje svih čimbenika koji dovode do suboptimalnih rezultata PCR-a. U strogo biokemijskom smislu, inhibicija je ograničena na aktivnost enzima, tj. smanjuje ili sprječava pretvorbu supstrat-produkt kroz interakciju s aktivnim mjestom DNA polimeraze ili njezinim kofaktorom (npr. Mg2+ za Taq DNA polimerazu).
Komponente u uzorku ili različiti puferi i ekstrakti koji sadrže reagense mogu izravno inhibirati enzim ili uhvatiti njegove kofaktore (npr. EDTA), čime inaktiviraju polimerazu i zauzvrat dovode do smanjenih ili lažno negativnih rezultata PCR.
Međutim, mnoge interakcije između reakcijskih komponenti i nukleinskih kiselina koje sadrže metu također se nazivaju 'PCR inhibitori'. Nakon što se izolacijom naruši integritet stanice i nukleinska kiselina se oslobodi, može doći do interakcija između uzorka i okolne otopine i čvrste faze. Na primjer, 'čistači' mogu vezati jednolančanu ili dvolančanu DNK kroz nekovalentne interakcije i ometati izolaciju i pročišćavanje smanjujući broj meta koje na kraju dospiju u PCR reakcijsku posudu.
Općenito, inhibitori PCR-a prisutni su u većini tjelesnih tekućina i reagensima koji se koriste za kliničke dijagnostičke pretrage (urea u urinu, hemoglobin i heparin u krvi), dodacima prehrani (organske komponente, glikogen, masti, Ca2+ ioni) i komponentama u okolišu (fenoli , teški metali)

Prevalentniji inhibitori PCR-a mogu se naći u bakterijama i eukariotskim stanicama, neciljanoj DNA, makromolekulama koje vežu DNA matrice tkiva i laboratorijskoj opremi kao što su rukavice i plastika. Pročišćavanje nukleinskih kiselina tijekom ili nakon ekstrakcije je poželjna metoda za uklanjanje PCR inhibitora.
Danas razna automatizirana oprema za ekstrakciju može zamijeniti mnoge ručne protokole, ali 100% oporavak i/ili pročišćavanje meta nikada nije postignuto. Potencijalni inhibitori mogu još uvijek biti prisutni u pročišćenim nukleinskim kiselinama ili su možda već djelovali. Postoje različite strategije za smanjenje utjecaja inhibitora. Izbor odgovarajuće polimeraze može imati značajan utjecaj na aktivnost inhibitora. Druge dokazane metode za smanjenje PCR inhibicije su povećanje koncentracije polimeraze ili primjena aditiva kao što je BSA.
Inhibicija PCR reakcija može se dokazati korištenjem interne kontrole kvalitete procesa (IPC).
Potrebno je pažljivo ukloniti sve reagense i druge otopine u priboru za ekstrakciju, kao što su etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanol i fenol, iz izolata nukleinske kiseline korakom temeljitog pranja. Ovisno o njihovoj koncentraciji, mogu aktivirati ili inhibirati PCR.