Testiranje metilacije DNK u kombinaciji s pametnim telefonima za rano otkrivanje tumora i leukemije s točnošću od 90,0%!

Rano otkrivanje raka na temelju tekuće biopsije novi je smjer otkrivanja i dijagnosticiranja raka koji je posljednjih godina predložio američki Nacionalni institut za rak, s ciljem otkrivanja ranog raka ili čak prekanceroznih lezija. Široko se koristi kao novi biomarker za ranu dijagnozu različitih malignih bolesti, uključujući rak pluća, gastrointestinalne tumore, gliome i ginekološke tumore.

Pojava platformi za identifikaciju biomarkera metilacijskog krajolika (Methylscape) ima potencijal značajno poboljšati postojeći rani probir za rak, dovodeći pacijente u najraniju izlječivu fazu.

Nedavno su istraživači razvili jednostavnu i izravnu platformu za detekciju metilacijskog krajolika temeljenu na nanočesticama zlata ukrašenim cisteaminom (Cyst/AuNP) u kombinaciji s biosenzorom temeljenim na pametnom telefonu koja omogućuje brzi rani probir širokog raspona tumora. Rani probir na leukemiju može se provesti unutar 15 minuta nakon ekstrakcije DNK iz uzorka krvi, s točnošću od 90,0%. Naslov članka je Brzo otkrivanje DNK raka u ljudskoj krvi korištenjem AuNP-ova prekrivenih cisteaminom i pametnog telefona s omogućenim strojnim učenjem.

Slika 1. Jednostavna i brza platforma za detekciju raka putem komponenti Cyst/AuNPs može se ostvariti u dva jednostavna koraka.

To je prikazano na Slici 1. Prvo je vodena otopina korištena za otapanje fragmenata DNA. Cyst/AuNP su zatim dodane u miješanu otopinu. Normalna i maligna DNA imaju različita svojstva metilacije, što rezultira fragmentima DNA s različitim obrascima samoslaganja. Normalna DNA se labavo agregira i na kraju agregira Cyst/AuNP, što rezultira crvenom prirodom Cyst/AuNP, tako da se promjena boje iz crvene u ljubičastu može vidjeti golim okom. Nasuprot tome, jedinstveni profil metilacije DNA raka dovodi do stvaranja većih nakupina fragmenata DNA.

Slike ploča s 96 jažica snimljene su kamerom pametnog telefona. DNK raka mjerena je pametnim telefonom opremljenim strojnim učenjem u usporedbi s metodama temeljenim na spektroskopiji.

Probir raka u stvarnim uzorcima krvi

Kako bi proširili korisnost platforme za očitavanje, istraživači su primijenili senzor koji je uspješno razlikovao normalnu i kancerogenu DNK u stvarnim uzorcima krvi. Obrasci metilacije na CpG mjestima epigenetički reguliraju ekspresiju gena. U gotovo svim vrstama raka uočeno je da se promjene u metilaciji DNK, a time i u ekspresiji gena koji potiču tumorogenezu, izmjenjuju.

Kao model za druge vrste raka povezane s metilacijom DNA, istraživači su koristili uzorke krvi pacijenata s leukemijom i zdravih kontrolnih osoba kako bi istražili učinkovitost metilacijskog krajobraza u diferencijaciji leukemijskih karcinoma. Ovaj biomarker metilacijskog krajobraza ne samo da nadmašuje postojeće metode brzog probira za leukemiju, već i pokazuje izvedivost proširenja na rano otkrivanje širokog raspona karcinoma pomoću ovog jednostavnog i izravnog testa.

Analizirana je DNK iz uzoraka krvi 31 pacijenta s leukemijom i 12 zdravih osoba. Kao što je prikazano na dijagramu na slici 2a, relativna apsorbancija uzoraka raka (ΔA650/525) bila je niža od one DNK iz normalnih uzoraka. To je uglavnom bilo zbog pojačane hidrofobnosti koja je dovela do guste agregacije DNK raka, što je spriječilo agregaciju Cyst/AuNP. Kao rezultat toga, te su nanočestice bile potpuno dispergirane u vanjskim slojevima agregata raka, što je rezultiralo različitom disperzijom Cyst/AuNP adsorbiranih na normalnim i agregatima DNK raka. ROC krivulje su zatim generirane promjenom praga od minimalne vrijednosti ΔA650/525 do maksimalne vrijednosti.

Slika 2.(a) Relativne vrijednosti apsorbancije otopina cista/AuNPs koje pokazuju prisutnost normalne (plava) i kancerogene (crvena) DNA pod optimiziranim uvjetima

(DA650/525) kutijastih dijagrama; (b) ROC analiza i evaluacija dijagnostičkih testova. (c) Matrica konfuzije za dijagnozu normalnih i onkoloških pacijenata. (d) Osjetljivost, specifičnost, pozitivna prediktivna vrijednost (PPV), negativna prediktivna vrijednost (NPV) i točnost razvijene metode.

Kao što je prikazano na slici 2b, površina ispod ROC krivulje (AUC = 0,9274) dobivena za razvijeni senzor pokazala je visoku osjetljivost i specifičnost. Kao što se može vidjeti iz kvadratnog dijagrama, najniža točka koja predstavlja normalnu skupinu DNA nije dobro odvojena od najviše točke koja predstavlja skupinu DNA raka; stoga je korištena logistička regresija za razlikovanje normalne i skupine raka. S obzirom na skup neovisnih varijabli, procjenjuje se vjerojatnost pojave događaja, poput skupine raka ili normalne skupine. Zavisna varijabla kreće se između 0 i 1. Rezultat je stoga vjerojatnost. Vjerojatnost identifikacije raka (P) odredili smo na temelju ΔA650/525 na sljedeći način.

gdje je b=5,3533, w1=-6,965. Za klasifikaciju uzorka, vjerojatnost manja od 0,5 ukazuje na normalan uzorak, dok vjerojatnost od 0,5 ili veća ukazuje na uzorak raka. Slika 2c prikazuje matricu konfuzije generiranu unakrsnom validacijom bez utjecaja metode, koja je korištena za validaciju stabilnosti metode klasifikacije. Slika 2d sažima evaluaciju dijagnostičkog testa metode, uključujući osjetljivost, specifičnost, pozitivnu prediktivnu vrijednost (PPV) i negativnu prediktivnu vrijednost (NPV).

Biosenzori na pametnim telefonima

Kako bi dodatno pojednostavili testiranje uzoraka bez upotrebe spektrofotometara, istraživači su koristili umjetnu inteligenciju (AI) za interpretaciju boje otopine i razlikovanje normalnih od kancerogenih osoba. S obzirom na to, računalni vid je korišten za prevođenje boje otopine Cyst/AuNPs u normalnu DNK (ljubičasta) ili kancerogenu DNK (crvena) koristeći slike ploča s 96 jažica snimljene kamerom mobilnog telefona. Umjetna inteligencija može smanjiti troškove i poboljšati dostupnost interpretacije boje otopina nanočestica, i to bez upotrebe bilo kakvog optičkog hardvera ili pribora za pametne telefone. Konačno, dva modela strojnog učenja, uključujući Random Forest (RF) i Support Vector Machine (SVM), obučena su za konstrukciju modela. Oba RF i SVM modela ispravno su klasificirala uzorke kao pozitivne i negativne s točnošću od 90,0%. To sugerira da je upotreba umjetne inteligencije u biosenzorima temeljenim na mobilnim telefonima sasvim moguća.

Slika 3.(a) Ciljana klasa otopine snimljena tijekom pripreme uzorka za korak snimanja slike. (b) Primjer slike snimljene tijekom koraka snimanja slike. (c) Intenzitet boje otopine ciste/AuNPs u svakoj jažici ploče s 96 jažica izdvojene sa slike (b).

Koristeći Cyst/AuNP-ove, istraživači su uspješno razvili jednostavnu platformu za detekciju metilacijskog krajolika i senzor sposoban razlikovati normalnu DNK od DNK raka pri korištenju uzoraka stvarne krvi za probir leukemije. Razvijeni senzor pokazao je da je DNK ekstrahirana iz uzoraka stvarne krvi mogla brzo i isplativo otkriti male količine DNK raka (3nM) kod pacijenata s leukemijom u 15 minuta, te je pokazala točnost od 95,3%. Kako bi se dodatno pojednostavilo testiranje uzoraka uklanjanjem potrebe za spektrofotometrom, korišteno je strojno učenje za tumačenje boje otopine i razlikovanje normalnih i kancerogenih osoba pomoću fotografije mobitelom, a točnost je također postignuta na 90,0%.

Referenca: DOI: 10.1039/d2ra05725e